鄔春曉+張京春+劉玥+馬林沁+喬羽+雷舒雁+鄭喬仙

[摘要] 研究補(bǔ)腎清肝中藥配伍對(duì)間歇性低氧致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)采用改良的間歇性低氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立體外細(xì)胞損傷模型，以補(bǔ)腎清肝中藥有效成分配伍（異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷及川芎嗪）作為干預(yù)藥物，首先進(jìn)行中藥最優(yōu)配伍濃度體外篩選，然后選擇最優(yōu)配伍濃度作為干預(yù)劑量，觀察其對(duì)模型p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)。結(jié)果顯示異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷及川芎嗪在0.01 mg·L-1時(shí)具有最佳的體外抗炎效應(yīng)。間歇性低氧組NF-κB p65入核量及p-IκB較對(duì)照組與其他各組均顯著增加，同時(shí)免疫熒光染色NF-κB p65可見間歇性低氧組出現(xiàn)明顯NF-κB p65核移位表現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞黏附程度明顯增加；與間歇性低氧組相比，p38MAPK抑制劑組及補(bǔ)腎清肝中藥配伍組 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量及p-IκB表達(dá)量均明顯較少，內(nèi)皮細(xì)胞黏附明顯被抑制。該研究表明，補(bǔ)腎清肝中藥最優(yōu)濃度配伍通過(guò)將抑制p38MAPK的磷酸化作為起始，繼而阻斷了NF-κB的核移位行為，抑制其轉(zhuǎn)錄功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)間歇性低氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的保護(hù)效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 間歇性低氧； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 中藥； p38MAPK； NF-κB

[Abstract] This study aims to explore the intervention effect of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver on intermittent hypoxia（IH） induced injury model of HUVECs through p38MAPK/NF-κB signaling pathway in vitro. HUVECs injury model was induced by modified IH treatment. The effective components of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver including isochteroside， aucubin and ligustrazine were used as intervention drugs. The optimal compatibility concentration of them was screened in vitro， and then the optimal compatibility concentration was selected as the intervention dose to observe the effect on p38MAPK/NF-κB signaling pathway in IH induced injury model of HUVECs. The results showed that isochnae， aucubin and ligustrazine had the best anti-inflammatory effect at concentration of 0.01 mg·L-1. NF-κB p65 and p-IκB in the nucleus in IH group were significantly higher than those in the normal control（N） group and the other groups. Immunofluorescence staining showed significant translocation of NF-κB p65 nucleus in IH group， and HUVECs adhesion capacity in IH group was increased significantly. As compared with IH group， the expression levels of p-p38MAPK， NF-κB p65 and p-IκB in p38MAPK inhibitor（INH） group and Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver（GDC） group were significantly decreased， and HUVECs adhesion capacity in INH group and GDC group was significantly inhibited as well. The optimal concentration of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver can inhibit the phosphorylation of p38MAPK， and then inhibit the nuclear translocation and transcription function of NF-κB. This may be the mechanism of the protective effect of Chinese medicine on IH induced injury model of HUVECs.

[Key words] intermittent hypoxia； HUVECs； Chinese medicine； p38MAPK； NF-κB

《中國(guó)心血管病報(bào)告2016》指出，高血壓是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，50%～75%的腦卒中和40%～50%的心肌梗死發(fā)生均與血壓升高相關(guān)。阻塞型睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）是獨(dú)立于年齡、肥胖、吸煙等引起高血壓的重要危險(xiǎn)因素。OSAS患者睡眠中頻繁發(fā)生的呼吸暫停，使機(jī)體處于間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）和再氧合交替出現(xiàn)的特殊內(nèi)環(huán)境。IH不同于持續(xù)低氧的特點(diǎn)是存在低氧后的正常氧的插入，較持續(xù)低氧使更易于造成血管內(nèi)皮功能的損傷，是OSAS致高血壓靶器官損傷的重要機(jī)制之一[1]。中醫(yī)藥對(duì)高血壓在調(diào)節(jié)機(jī)體整體平衡、控制血壓水平穩(wěn)定及防治靶器官損害等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。作者在前期臨床實(shí)驗(yàn)中，深入探索高血壓病的中醫(yī)病機(jī)與證治規(guī)律，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎清肝中藥配伍治療輕中度高血壓具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能、調(diào)控血壓變異性等靶器官保護(hù)效應(yīng)[2]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)間歇性低氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮損傷建立體外模型，觀察補(bǔ)腎清肝中藥配伍對(duì)該模型p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)，以期為中藥對(duì)OSAS相關(guān)心血管疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 藥物 中藥鉤藤的有效成分異鉤藤堿（批號(hào)111927-201403）、中藥杜仲的有效成分桃葉珊瑚苷（批號(hào)111761-200601）、中藥川芎的有效成分川芎嗪（批號(hào)110817-201307）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 細(xì)胞來(lái)源 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）由健康產(chǎn)婦、正常分娩12 h內(nèi)臍帶的臍靜脈分離提取（臍帶由中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科提供）。

1.3 HUVECs的分離及培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取健康產(chǎn)婦、正常分娩12 h內(nèi)臍帶20～30 cm，PBS沖洗臍帶并去除兩端，鑷子擴(kuò)張靜脈腔，插入三通管并固定。三通管另一端連接針頭后插入倒置的PBS瓶中，抽推進(jìn)器使PBS流入針筒，關(guān)閉此開關(guān)閥后推推進(jìn)器使PBS流入臍帶，注意防止氣泡。以上操作清洗臍帶2～3次直至無(wú)肉眼可見血色。臍帶末端插入帶有膠皮管的針頭，重復(fù)清洗1次后，將連接三通管針頭插入0.1%膠原酶溶液瓶中，倒置酶瓶后抽推進(jìn)器使酶液流入針管，關(guān)閉此開關(guān)閥后推推進(jìn)器直至酶液充滿整條臍帶。臍帶置入37 ℃水浴15 min后回收消化液，PBS清洗后重復(fù)回收2次，收集消化液，加入預(yù)先室溫放置的ECM（20%FBS）5 mL，灌洗、離心（1 000 r·min-1，5 min）收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液按1×106～1.5×106個(gè)/mL接種于10 mL培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞90%以上單層融合狀態(tài)時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)至4～7代用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 間歇性低氧致HUVECs損傷模型的復(fù)制 模型復(fù)制方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行改進(jìn)[3]。使用低氧裝置Modular Incubator Chamber（MIC-101）（美國(guó) Billups-rothenberg）建立間歇性低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷細(xì)胞模型。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入低氧裝置中（預(yù)先紫外照射消毒），暴露時(shí)以低氧（1%O2，4%CO2，96%N2）氣流洗脫細(xì)胞培養(yǎng)艙中的氣體，監(jiān)測(cè)直至氧氣濃度達(dá)到5%后停止。繼而維持低氧狀態(tài)5 min（即IH時(shí)段），再以正常氧（21%O2）氣流洗脫低氧氣體，而后再維持10 min（即再氧合時(shí)段），周而復(fù)始形成循環(huán)2，4，6，8次逐級(jí)遞增至16次。

1.5 分組與干預(yù)方法 正常對(duì)照組（N）：將培養(yǎng)基換為無(wú)血清ECM，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4 h。間歇性低氧模型組（IH）：將培養(yǎng)基換為無(wú)血清ECM，置于低氧裝置內(nèi)，低氧/復(fù)氧循環(huán)16次（4 h）。補(bǔ)腎清肝中藥配伍組（GDC 1，0.1，0.01，0.001）：將異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷、川芎嗪均按1，0.1，0.01，0.001 mg·L-1加入到無(wú)血清ECM中，替換原培養(yǎng)基，低氧/復(fù)氧循環(huán)16次（4 h）。p38MAPK抑制劑組（INH）： 將培養(yǎng)基換為無(wú)血清ECM，p38MAPK阻斷劑SB203580 5 mg·L-1預(yù)處理30 min，此后置于低氧裝置內(nèi)，低氧/復(fù)氧循環(huán)16次（4 h）。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法 炎癥因子檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）技術(shù)測(cè)定HUVECs上清液中IL-1，IL-6，ICAM-1，E-selectin及TNF-α的含量。p38MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)：采用Western blot的方法檢測(cè)各組間p-p38MAPK表達(dá)量的變化。分離細(xì)胞胞漿、胞核蛋白后檢測(cè)NF-κB通路炎癥相關(guān)蛋白胞漿、胞核中表達(dá)量差異。HUVECs細(xì)胞間黏附能力檢測(cè)：熒光探針標(biāo)記THP-1細(xì)胞，加入處理后HUVEC 細(xì)胞37 ℃共孵育30 min，熒光顯微鏡下拍照比較黏附密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，2組以上比較采用One-way ANOVA，檢驗(yàn)顯著性水平定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎清肝中藥配伍最佳干預(yù)劑量的篩選 為探討補(bǔ)腎清肝中藥配伍的體外對(duì)炎癥因子的干預(yù)效應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行其最佳干預(yù)劑量的篩選，分別設(shè)立了異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷及川芎嗪1，0.1，0.01，0.001 mg·L-14個(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示補(bǔ)腎清肝中藥配伍在0.01 mg·L-1（GDC）這個(gè)劑量濃度時(shí)炎癥因子的表達(dá)IL-1，IL-6，TNF-α明顯低于其余各干預(yù)組（P<0.05），見圖1。因此選定0.01 mg·L-1作為最佳干預(yù)劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 補(bǔ)腎清肝中藥配伍最佳干預(yù)劑量對(duì)p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，IH組中NF-κB p65入核量、p-IκB較對(duì)照組與其他組均顯著增加，NF-κB通路明顯被激活。IκB，p-p65，IKK-β等無(wú)明顯變化，見圖2。同時(shí)免疫熒光染色NF-κB p65，Confocal鏡下可見IH組出現(xiàn)明顯NF-κB p65核移位表現(xiàn)。藍(lán)色標(biāo)記的HUVECs細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的NF-κB p65。入核后的NF-κB p65亮度明顯高于胞漿中表達(dá)的NF-κB p65，見圖2。INH組、GDC組 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量、p-IκB表達(dá)量與IH比較明顯較少，說(shuō)明補(bǔ)腎清肝中藥配伍及p38MAPK阻斷劑SB203580可通過(guò)抑制IH后p38MAPK的磷酸化阻斷其下游NF-κB信號(hào)通路。

2.3 補(bǔ)腎清肝中藥配伍最佳干預(yù)劑量對(duì)間歇性低氧誘導(dǎo)HUVECs損傷過(guò)程中 THP-1 細(xì)胞黏附的影響 熒光顯微鏡下觀察，正常對(duì)照（N）組（128.2±6.72）可見少量 THP-1細(xì)胞黏附；IH組（231.2± 8.43）可見明顯增加THP-1 細(xì)胞黏附；GDC組（134.8±8.67）可見明顯抑制THP-1細(xì)胞黏附于HUVEC；INH組（122.4±7.12）可見明顯抑制THP-1細(xì)胞黏附于HUVEC，見圖3。

3 討論endprint

在建立穩(wěn)定的間歇性低氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型基礎(chǔ)上，觀察了不同濃度的補(bǔ)腎清肝中藥配伍的干預(yù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷、川芎嗪在0.01 mg·L-1這個(gè)劑量時(shí)具有最佳的抑制炎癥因子的效應(yīng)，并不具有劑量依賴性。

大量研究報(bào)道補(bǔ)腎清肝中藥配伍的各有效組分（異鉤藤堿、桃葉珊瑚苷、川芎嗪）具有廣泛的心血管系統(tǒng)藥理作用。桃葉珊瑚苷是中藥杜仲的主要活性成分，具有明顯的抗炎活性，能夠抑制NF-κB的p65亞基由細(xì)胞胞漿內(nèi)向核內(nèi)的移位，并通過(guò)阻止IκB的磷酸化和降解，使胞漿內(nèi)IκB濃度升高，進(jìn)而抑制NF-κB活性從而下調(diào)TNF-α和IL-6的合成與表達(dá)[4]。對(duì)于桃葉珊瑚苷及桃葉珊瑚苷苷元抗炎活性的進(jìn)一步研究表明，真正發(fā)揮作用的分子可能是桃葉珊瑚苷水解產(chǎn)物桃葉珊瑚苷苷元，桃葉珊瑚苷苷元通過(guò)抑制細(xì)胞中NF-κB活性進(jìn)一步抑制TNF-α的生成[5-6]，與本研究結(jié)果一致。異鉤藤堿是茜草科植物鉤藤的主要有效成分，具有降壓及抗炎作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射異鉤藤堿可降低未開胸犬的平均動(dòng)脈壓；同時(shí)能夠調(diào)控NO的產(chǎn)生，降低磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白和p38MAPK，抑制炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)血管、降低血壓的作用[7-8]。研究表明川芎嗪可通過(guò)改善氧化應(yīng)激，降低炎性因子水平，拮抗Ca離子內(nèi)流，調(diào)控一氧化氮水平，抑制血管內(nèi)皮炎癥性損傷等實(shí)現(xiàn)降壓作用[9-11]。為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎清肝中藥配伍血管內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制，從體外角度觀察了中藥干預(yù)后模型NF-κB通路蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，補(bǔ)腎清肝中藥配伍最優(yōu)劑量組p-p38MAPK，p-IκB的表達(dá)明顯被抑制；同時(shí)采用免疫熒光標(biāo)記NF-κB p65，觀察到補(bǔ)腎清肝中藥配伍干預(yù)后的NF-κB p65入核量明顯減少。

綜上所述，補(bǔ)腎清肝中藥配伍將抑制p38MAPK的磷酸化作為起始，阻斷NF-κB的核移位，抑制其轉(zhuǎn)錄功能，最終實(shí)現(xiàn)其對(duì)間歇性低氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的保護(hù)效應(yīng)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint