關宏煒+徐麗君+董慧

[摘要] 中藥現(xiàn)代化研究逐步成為世界性的潮流。反向對接技術也逐步成為中藥現(xiàn)代化研究的有利工具，將一個小分子藥物對接在一組臨床相關大分子靶標的潛在結合腔中，通過對結合特征的詳細分析，根據(jù)結合緊密程度對靶標進行排名，從而潛在地鑒定可能與其作用機制或副作用相關藥物的新分子靶標。近年來，為了探索中藥的作用機制、篩選中藥有效成分以及尋找藥物作用于疾病的靶點，反向分子對接技術被廣泛運用并取得了矚目的成績。該研究通過文獻綜述，總結反向分子對接技術應用于中藥作用靶點、有效成分篩選及中藥潛在作用機制探索的情況，為中藥臨床研究及新藥研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

[關鍵詞] 中藥； 反向分子對接； 對接軟件； 數(shù)據(jù)庫

[Abstract] Traditional Chinese medicine（TCM） modernization has gradually become a worldwide trend. Reverse docking technology has also gradually become a useful tool for TCM modernization. It involves docking a small-molecule drug in the potential binding cavities of a set of clinically relevant macromolecular targets. Detailed analysis of the binding characteristics was used for the ranking of the targets according to the tightness of binding. This process can be used to potentially identify the novel molecular targets for the drug which may be relevant to its mechanism of action or side effect.In order to explore the action mechanism， screen the active ingredients and seek the treating target of TCM， reverse molecular docking technology has been widely used and has achieved remarkable results in recent years. In this review， we summarized the application of reverse molecular docking technology in the target seeking， active ingredients screening and potential mechanism exploration of TCM， which may provide more scientific basis for the clinical research and development of new herbal drugs.

[Key words] traditional Chinese medicine； reverse molecular docking； docking software； database

目前，藥物研發(fā)處于瓶頸時期，使用傳統(tǒng)的“多個配體-單靶點”[1]的研發(fā)方法使得藥物創(chuàng)新變得困難，發(fā)現(xiàn)一個新分子實體并應用于市場的成本超過20億美元[1]，然而回報率卻遠遠低于投資成本且耗時?！岸鄠€靶點-單配體”研究策略即反向分子對接技術有效的解決了這些難題，并成為藥物重新定位的有利工具，尤其是在中藥相關靶點篩選方面應用廣泛。

中藥治療疾病的有效性有目共睹，且副作用小，但中藥發(fā)揮治療作用的成分及作用于疾病的相關靶點與作用機制仍然不明確。如何尋找中藥治療疾病的相關靶點，如何找到中藥治療疾病的有效成分，如何預測中藥潛在的作用機制，是科研人員面臨的亟待解決的難題。反向分子對接技術[2]是基于分子對接技術之上，是分子對接技術的逆向思考，它以小分子或者化合物作為探針，在具有三維結構的靶點數(shù)據(jù)庫內進行對接，通過空間匹配和計算小分子與靶點之間的能量，對小分子化合物作用靶點進行篩選，從而預測藥物作用的潛在靶點。反向分子對接技術基于“鎖鑰匙模型”[3]，在一組與臨床相關的大分子靶標結合腔中插入小分子藥物配體，根據(jù)結合緊密程度對靶標蛋白質進行排名。反向對接以藥物小分子或者化合物作為探針，在已知的靶點數(shù)據(jù)庫里面搜索可能與之結合的生物靶點大分子，通過空間和能量匹配相互識別形成復合物，鑒定藥物潛在的作用機制以及副作用或者配體的分子靶標?，F(xiàn)將反向分子對接技術及其在中藥作用靶點、中藥有效成分篩選及中藥潛在作用機制預測中的應用進展予以綜述。

1 反向分子對接有關數(shù)據(jù)庫介紹

反向分子對接技術需要在數(shù)據(jù)庫中搜索相應的小分子及生物大分子的分子結構。搜索相關文獻，得知小分子結構數(shù)據(jù)庫包括[4-6]：中藥小分子數(shù)據(jù)庫（TCM Database@Taiwan，CNPD，CHCD，CHDD，BPCD，TCM-ID，TCM-PCD，CHMIS-C，GPNDBTM，CEMTDD，CVDHD，Chem-TCM）及其他小分子結構數(shù)據(jù)庫（PubChem，ZINC，DrugBank，NIH Chemical Genomics Center Pharmaceutical Collection，World Drug Index，ChEMBL數(shù)據(jù)庫）等。其中TCM Database@Taiwan[7]可在http：//tcm.cmu.edu.tw/中搜索獲得，TCM-PCD獲取的地址是http：//pharminfo.zju.edu.cn/ptd；CHMIS-C可以通過http：//sw16. im.Med.umich.edu/chmis-c/獲取；PubChem[8]通過 https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov獲得，是2004年發(fā)布的化學物質及其生物活性信息的公共存儲庫。endprint

疾病相關靶點數(shù)據(jù)庫[4] PDTD，PDB，TTD，BindingDB，KiBank，AffinDB，MMDB，TargetBank，sc-PDB，PDBbind，RELIBASE等。其中數(shù)據(jù)庫PDTD[9]（蛋白質藥物靶標數(shù)據(jù)庫）具有已知3D結構的藥物靶點，可在http：//www.dddc.ac.cn/pdtd/上在線獲?。籔DB[10]（蛋白質數(shù)據(jù)庫）包含7萬多個蛋白質結構信息，該數(shù)據(jù)庫可在http：//www.rcsb.org/pdb/訪問；TTD[11]（治療靶標數(shù)據(jù)庫）可在http： //bidd.nus.edu.sg/group/cjttd /TTD.asp訪問。

2 反向分子對接技術的發(fā)展進程及其相關軟件簡介

2.1 對接軟件INVDOCK

對接軟件是分子反向對接中必不可少的一部分，首款反向對接軟件INVDOCK，可自動鑒別小分子蛋白質和核苷酸靶點。此軟件主要用來預測藥物的潛在毒性和副作用，提供藥物的可能治療靶點，以及檢測在中草藥和配方中一組分子的協(xié)同作用。因操作過程相對繁瑣，很少作為對接軟件的首選。

2.2 對接軟件TarfisDock

在INVDOCK基礎之上開發(fā)出一款比較簡快捷的軟件TarfisDock[12]，它是中國科學院上海藥物研究所蔣華良課題組開發(fā)的藥物靶點預測的免費公共平臺。通過搜索數(shù)據(jù)庫PDTD，在數(shù)小時的時間里就可以找到小分子作用靶點，可在http：//www.dddc.ac.cn/tarfisdock/搜索。然而，Tarfis Dock仍然有一定的局限性[12]：蛋白質條目不足以覆蓋疾病相關基因組的所有蛋白質信息，反向對接的評分功能不夠準確。

2.3 對接軟件 PharmMapper

繼TarfisDock之后，一款免費網(wǎng)絡服務器PharmMapper[13]問世，是基于TargetBank，DrugBank，BindingDB，PDTD四大數(shù)據(jù)庫進行靶點的搜索，可以在http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/上免費獲得。但是PharmMapper仍然存在一定局限性：藥效團數(shù)據(jù)庫僅包括具有共結晶配體的PDB結構的藥物靶標。

2.4 對接軟件ReverseScreen3D

ReverseScreen3D[14]由英國麗茲大學Jackson RM課題組研發(fā)，ReverseScreen3D可以在http//www.modelling.leeds上免費獲得。主要限制是人類基因組以及其他與疾病有關基因組的結構覆蓋率差。

2.5 對接軟件idTarget

idTarget[15]是一款在線免費服務器，用于識別化學小分子的生物分子靶標的網(wǎng)絡服務器，具有強大的評分功能，可以在http：//idtarget.rcas.sinica.edu.tw免費獲得；此軟件已經成功應用于蛋白激酶抑制劑和他汀類藥物靶點的預測[16-17]。

2.6 對接軟件AutoDock

AutoDock[18]由Scripps研究所的Olson實驗室開發(fā)與維護，運用拉馬克遺傳算法來計算配體與受體之間最佳的結合狀態(tài)[19]；AutoDock軟件由 AutoGrid 和 AutoDock 2個程序組成，還具備分子可視化輔助對接軟件AutoDock Tools（ADT）程序[20]，在http：//autodock.scripps.edu/上直接下載即可安裝。

3 反向分子對接技術在中藥靶點預測、有效成分篩選及毒副作用機制等方面的研究

關于中藥潛在靶點預測的文獻報道層出不窮，中藥成分的復雜性致使其作用靶點的多樣性，即使用指紋圖譜等試驗方法得到中藥的主要成分，通過虛擬篩選等手段也很難得到“一藥一靶”或者“一種成分一個靶點”的結果。中藥有效成分及其藥理作用的報道不計其數(shù)，但是絕大多數(shù)的作用機制不詳，部分藥物的藥理成分即使被證實，其有效成分的藥理活性、作用機制仍然不清楚，發(fā)現(xiàn)藥理活性的過程十分艱難；藥物安全評估是新藥開發(fā)的主要課題，動物實驗和臨床試驗的目標之一是評估候選藥物的毒性和副作用，然而用于藥物開發(fā)的這些試驗耗費了大量的時間和金錢，且成功率較低[1]。臨床上少用單味中藥而多用復方治療疾病，很難判定發(fā)揮療效的是單味中藥還是多味中藥的協(xié)同作用，基于中藥成分復雜性、多樣性的特性，闡明中藥發(fā)揮療效成分的作用機制需要用更精確的科學數(shù)據(jù)。反向分子對接技術很好的解決了這一難題，“多靶點-單配體”對接模式根據(jù)空間和能量匹配，小分子化合物與生物大分子相互識別形成分子復合物，從而預測藥物潛在作用靶點、藥物潛在的作用機制、新藥毒性及副作用以及中藥復方作用機制，節(jié)約成本和時間。

3.1 反向對接技術在中藥潛在靶點預測方面的應用

3.1.1 在中藥治療心血管疾病靶點預測方面的應用 在心血管疾病治療用藥方面，中藥發(fā)揮著不可忽視的作用，但是作用靶標尚不明確，反向對接技術為藥物潛在靶點的預測提供了新思路[21]。研究人員[22]運用INVDOCK軟件，建立表皮生長因子到丹酚酸B信號相關蛋白的信號網(wǎng)絡，闡明了丹酚酸B治療心血管疾病方面的機制，與表皮生長因子是丹酚酸B的直接作用靶標有關。有研究[23]為了探討丹酚酸B對阿霉素誘導心肌細胞毒性的保護作用及其可能的作用靶標蛋白，運用PharmMapper進行反向對接，預測相關作用靶點，用AutoDock做正向對接以驗證反向對接結果，得出結論丹酚酸B對阿霉素誘導的心肌細胞有一定保護作用，作用靶點可能是調控絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 12 和 DNA 拓撲異構酶 2。Zhao Jing等[24]通過中藥黃芪提取物黃芪甲苷的研究，采用INVDOCK軟件，從DrugBank中下載與心血管疾病相關的藥物以及相應的靶標，構建藥物靶點網(wǎng)絡，在39個預測目標中驗證了3個相關性極高的靶點：鈣調神經磷酸酶（CN），血管緊張素轉換酶（ACE）和c-Jun N-末端激酶（JNK），為進一步證實黃芪甲苷治療心血管疾病的機制提供依據(jù)。endprint

3.1.2 在中藥抗腫瘤靶點預測方面的應用 在中藥抗腫瘤靶點預測方面，反向分子對接技術發(fā)揮了重要作用，有研究人員[25]運用AutoDock和Tarfisdock 2種對接軟件，實施2個單獨的計算機工作流程，從PDTD蛋白數(shù)據(jù)庫中篩選出幾種具有抗腫瘤作用的臨床重要蛋白質作為2種方法的潛在受體，預測茶葉抗腫瘤的潛在靶點。通過實驗證實EGCG潛在抗腫瘤的受體有谷胱甘肽還原酶，過氧化氫酶和eEF1-α等，還包括常規(guī)的抗腫瘤靶點如角鯊烯氧化物環(huán)化酶，白三烯A4水解酶（LTA4H）等；本研究為EGCG及其衍生物的抗腫瘤機制和新靶向藥物設計研究提供了重要信息。研究茶葉功能組分ECG，EGC，EC，EGCG的抗腫瘤機制。Chen Shao-Jun等[26]使用PharmMapper和idTarget服務器作為工具，并用PyRx 0.8中的分子對接程序AutoDock Vina檢查結果，得出丹參素的潛在抗癌靶標可能是HRas。Jeong Chul-Ho等[27]在PDTD數(shù)據(jù)庫中搜索與腫瘤相關的靶點，運用TarfisDock軟件對姜的天然成分姜黃素進行反向對接，發(fā)現(xiàn)白三烯A4水解酶（LTA4H）是姜黃素抗腫瘤的靶點。陳少軍等[28]以丹參醇A為研究對象，以PharmMapper為反向對接工具，發(fā)現(xiàn)了丹參醇A與靶蛋白醛糖還原酶的打分靠前，用正向對接驗證發(fā)現(xiàn)丹參醇A與醛糖還原酶有相互作用，闡明了丹參醇A的抗腫瘤靶點可能是醛糖還原酶。

3.1.3 在中藥治療其他疾病靶點預測方面的應用 Chen Shao-Jun等[29]運用PharmMapper對丹參酮ⅡA進行反向對接，運用AutoDock Vina在PyRx 0.8中進行驗證，得出結果視黃酸受體α（RARα）可能是丹參酮ⅡA對急性早幼粒細胞白血病APL的潛在靶標。劉秀峰等[30]采用AutoDock4.2進行反向對接，利用AutoGrid程序產生網(wǎng)格地圖，研究對象雷公藤內酯醇及其3種相似物的三維立體結構利用軟件Discovery Studio 2.5繪制并且優(yōu)化，對于相互作用的可視化以及蛋白和配體間的分子結構和氫健采用軟件Discovery Studio 2.5完成；將3個化合物對接到多個核受體類蛋白（NRs）的活性位點上，確定雌激素受體α為其作用靶點，并且通過體外重組和其他的實驗進行了驗證。Hsieh Sheng-Kuo等[31]運用Discovery Studio 2.1對生長激素促分泌素受體進行同源建模，選擇PDF總能量最低的生長激素促分泌素受體（GHSR）結構進一步對接生長激素釋放激素-6（GHRP-6）和銀杏葉素；GHRP-6的3D結構從PubChem數(shù)據(jù)庫下載，銀杏葉素3D結構在Chem3D程序上創(chuàng)建，銀杏葉素和GHRP-6與GHSR的對接過程在Discover Studio 2.1中的LipDock組件上完成；分子建模和對接顯示，Ginkgoghrelin以及GHRP-6可以適應并充分與生長素釋放肽受體的結合袋相互作用。表明Ginkgoghrelin可能通過活化生長素釋放肽受體影響銀杏的抗衰老作用，并且具有很大的潛力被開發(fā)為生長素釋放肽的非肽類似物。

3.2 反向分子對接技術在闡明中藥效應成分與靶標的作用及其相關機制的應用

3.2.1 在闡明中藥效應成分與腫瘤相關靶標的作用機制的應用 反向分子對接除了預測小分子化合物作用的靶點，還可以通過已知的小分子化合物的藥理作用和相關的靶標進行對接，從分子水平闡明中藥效應成分與靶標的作用機制。有研究人員[32]利用AutoDock Vina對土貝母皂苷甲進行反向對接，發(fā)現(xiàn)其與多個抗腫瘤靶標具有很高的親和力，為進一步研究土貝母皂苷甲抗腫瘤機制提供了依據(jù)，同時也預測到貝母皂苷甲具有抗腫瘤的作用。成功預測土貝母皂苷可以通過抑制酪蛋白激酶Ⅱ、金屬基質蛋白酶-8、Src激酶、胸苷酸合成酶、CDK2以及微管蛋白的活性，發(fā)揮抗腫瘤的作用。Biplab Bhattacharjee等[33]利用idTarget和PharmMapper 2種虛擬篩選的方法對藏紅花有效成分的抗腫瘤靶點進行篩選，從而預測藏紅花生物活性成分的抗腫瘤機制。具體采用Fitscore 和Binding能量分級對對接結果進行分析，得到一組與多種形式的癌癥相關蛋白，結果的有效性通過AutoDock軟件對藏紅花苦苷及Hsp90α對接形態(tài)進行詳細分析驗證；藏紅花生物活性成分（藏花酸、藏花醛、藏紅花苦苷）小分子結構（sdf文件格式）從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得，在MarvinSketch中將格式轉換成moll格式，藥效團模型從PharmTargetDB中得到；利用AutoDock試驗再現(xiàn)，從RSCS-PDB（PDB ID：4EGI）檢索的Hsp90α和其內置的結晶配體B2J的結構與Hsp90重新對接。比較了原始B2J-Hsp90α復合物與后置對接模擬B2J-Hsp90α復合物結合姿勢的分子相互作用，找出了研究中AutoDock作為相互作用工具的可靠性，進而驗證了藏紅花生物活性成分及其抗腫瘤機制的可靠性。

3.2.2 在闡明中藥效應成分與炎癥相關靶標的作用機制的應用 研究人員[34]以炎癥通路上30個驗證蛋白為研究對象，從Pubchem上下載的大黃酸的結構信息，通過軟件AutoDock使大黃酸與炎癥通路上的蛋白進行對接，得到3個與大黃酸具有高親和性的靶蛋白：p38MAPK，PI3K7，JAK2，比較對接自由能，得出大黃酸發(fā)揮抗炎作用的機制是通過抑制p38MAPK，PI3K7，JAK2靶蛋白，從而阻礙炎癥信號傳遞，影響下游蛋白的表達，發(fā)揮抗炎作用。還有研究人員[35]用軟件ChemBioOffice中的ChemBioDraw和Sybyl-X1.1對車前草34個化合物的二維結構和cx2，lpxx，4cox進行分子對接，cx2，lpxx，4cox從PDB數(shù)據(jù)庫里面下載，并且經過試驗證明具有明確的抗炎作用，對接結果顯示排名前7位的化合物依次為桃葉珊瑚苷、車前草苷B、阿魏酸、6-羥基木犀草素、芹菜素、京尼平甙酸、梓醇的對接得分最高，進一步闡明了車前草化合物的抗炎機制。徐佑東等研究者[36]以黃連堿為研究對象，運用對接軟件AutoDock，對TLR4/NF-κB，p38MAPK，JAK2/STAT33條通路上的蛋白進行反向篩選，最終篩選出4種與黃連堿具有高親和力的靶標蛋白：PI3Kδ，PI3Kγ，IKKβ，PI3Kα；闡明黃連堿可以通過抑制這4個靶蛋白進而阻礙炎癥信號傳遞，發(fā)揮抗炎作用。endprint

3.3 反向分子對接技術在評價藥物毒副作用機制中的作用

藥物的毒副作用在新藥的篩選中起著決定性的作用，研發(fā)的新藥是否上市及上市的藥物是否被撤市，取決于該藥物的不良反應，反向對接技術可以快速的預測出藥物的毒副作用，有利于降低藥物研發(fā)的成本，減少新藥研發(fā)的時間。Chen Y Z等[37]運用INVDOCK對數(shù)據(jù)庫中與毒性和副作用相關的蛋白靶標進行自動搜索，對阿司匹林，青霉素，布洛芬等藥物的3D結構進行對接，發(fā)現(xiàn)了這些藥物的毒副作用。他們[38]還通過與 TTD，DART 和 ADMEA 三大藥物潛在靶點數(shù)據(jù)庫相連，成功對四氫他莫昔芬和維生素E的作用靶點、毒性和副作用以及代謝特征進行了預測。

3.4 反向對接技術在闡明中藥復方作用機制中的應用

反向對接技術不僅在單味中藥靶點預測以及作用機制研究中占有重要地位，在中藥復方研究中也有一定的涉足。高耀等[39]通過DrugBank 數(shù)據(jù)庫中 FDA 批準抗抑郁藥物靶點的比對篩選，借助 MAS3.0 生物分子功能軟件靶點信息的注釋，采用 Cytoscape 軟件構建逍遙散成分-靶點-通路網(wǎng)絡，闡明了逍遙散抗抑郁作用體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點，其成功地依據(jù)反向藥效團匹配方法預測25 個可能與逍遙散治療抑郁癥相關聯(lián)的潛在作用靶點。程彬峰等[40]利用PharmMapper等生物信息學手段對清肺消炎丸的化學成分進行吸收、靶點及作用通路的預測分析； 并結合豚鼠哮喘模型和人支氣管上皮細胞炎癥模型，采用基因芯片研究其對相關炎癥基因表達的影響，以此建立了“藥物-靶點-通路-網(wǎng)絡 ”的研究模式，初步揭示了清肺消炎丸能通過影響 ERK1 等基因的表達進而干預黏著斑，F(xiàn)c epsilon RI，Toll樣受體，NK細胞介導的細胞毒以及 ERK/MAPK等 5 條通路發(fā)揮抗炎作用。劉昌孝等[41]利用PharmMapper建立元胡止痛滴丸中 28 個入血成分的化合物-靶蛋白網(wǎng)絡，通過KEGG數(shù)據(jù)庫對獲取的靶點及相關通路進行分析，利用 Cytoscape 軟件構建元胡止痛滴丸的“化合物-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖，得知元胡止痛滴丸可能通過激素調節(jié)、中樞鎮(zhèn)痛、解痙、炎癥及免疫相關的蛋白靶點及通路，起到鎮(zhèn)靜止痛的治療作用。

4 展望

現(xiàn)階段對中藥的現(xiàn)代化研究已經進入了一個新時期，運用現(xiàn)代科學技術與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相結合，闡明中藥的作用機制以及藥理作用，是中藥研究突破的中藥思路，反向分子對接為中藥研究提供了一個新思路，在中藥研究領域的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)出來。通過評分功能以及能量匹配的方式，“單配體-多靶點”或者“一種化合物成分-一個靶點”的對接模式，能快速地找到藥物作用的相關靶點，進而探索中藥成分治療疾病的作用機制。另外，對接程序的不斷優(yōu)化以及數(shù)據(jù)庫的不斷完善，加快了藥物研究的進展，節(jié)約藥物研發(fā)的投資成本。但是反向分子對接也有一定的局限性，計算機模擬對接數(shù)據(jù)不能完全代替體內實驗數(shù)據(jù)；對接分數(shù)高，親和力高的不一定就說明配體作用較好，還需要與其他實驗方法相結合，利用生物實驗進行驗證。另外對接軟件的復雜性及多樣性，以及中藥本身結構和成分的復雜性，數(shù)據(jù)庫的更新速度慢，讓很多剛入門的學者耗費大量精力，但是隨著理論和技術的不斷完善，反向分子對接在中藥中的運用將會再次邁入一個新階段。

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[責任編輯 張寧寧]endprint