翟一帆,袁青彬,胡 南

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境工程學(xué)院,江蘇 南京 211800)

養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)中復(fù)雜的微生物種群對(duì)處理效果和后續(xù)出水安全性具有顯著影響。據(jù)報(bào)道,養(yǎng)殖廢水的微生物主要有硝化螺菌屬、芽單孢菌屬、子囊菌門(mén)等[13],另外還存在彎曲桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌[14-16]。目前對(duì)養(yǎng)殖廢水處理過(guò)程中真菌類(lèi)群的種類(lèi)及其豐度變化的研究極少。另外,廢水處理系統(tǒng)中微生物種類(lèi)可能受到多種因素的影響[17],從而對(duì)處理效果造成顯著影響,但目前對(duì)養(yǎng)殖廢水微生物的相關(guān)研究報(bào)道也很少。定量表征養(yǎng)殖廢水處理過(guò)程中微生物種群變化的影響因素,對(duì)揭示微生物種群變化規(guī)律具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

樣本取自宿遷市沭陽(yáng)縣某養(yǎng)豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng),該養(yǎng)豬場(chǎng)的生豬養(yǎng)殖規(guī)模約10 000頭,廢水排放量為150 m3/d。養(yǎng)豬場(chǎng)污水處理工藝經(jīng)厭氧-缺氧-好氧塘處理后排放。取樣時(shí)間為2015年8月中旬,取樣點(diǎn)位包括進(jìn)水口、厭氧池、缺氧池、好氧曝氣池和出水口。每個(gè)點(diǎn)位廢水取4 000 mL置于5 000 mL無(wú)菌PV瓶,取樣后密封放入冰桶中,4 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 微生物群落分析

1.2.1 DNA提取

收集的水樣通過(guò)0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾,濾膜剪碎后置于DNA提取管。采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(OMEGA)土壤DNA提取試劑盒進(jìn)行提取,提取過(guò)程參照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳 (Biolab,USA)進(jìn)行鑒定,并用微量分光光度計(jì)(NanoDrop 8000, NanDrop Technologies, Willmington, USA)測(cè)定濃度。

1.2.2 高通量測(cè)序

將提取的DNA樣品為PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S和真菌的18S,引物為細(xì)菌:515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),真菌:ITS1F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR 采用TransStartFastpfu DNA Polymerase,20 μL反應(yīng)體系:4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/LdNTP,0.8 μL正向和反向引物(5 μmol/L),0.4 μLFastPfu Polymerase,1 μL DNA,補(bǔ)ddH2O至總體積為20 μL。PCR送至深圳恒創(chuàng)基因有限公司,采用Illumina MiSeq高通量DNA測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)GreenGene(16S、葉綠體、線(xiàn)粒體), RDP(16S), Silva(18S), Unite(ITS)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得物種注釋信息(置信度閾值默認(rèn)為0.8以上)。采用KRONA、Mega 4.0、BioEdit軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),采用UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)聚類(lèi)分析方法構(gòu)建樣品的聚類(lèi)樹(shù)。

1.3 水質(zhì)檢測(cè)

1.4 冗余性分析

使用Canoco 4.5研究微生物種群和水質(zhì)因子間的相關(guān)性。首先,對(duì)物種矩陣進(jìn)行趨勢(shì)分析,得出第一排序軸長(zhǎng)度相對(duì)較短(<4),所以選用線(xiàn)性模型冗余性分析法對(duì)物種組成數(shù)據(jù)與堆肥環(huán)境因子進(jìn)行多元相關(guān)性分析;再采用手動(dòng)選擇方式,用Monte Carlo permutation test檢驗(yàn)顯著性,置換次數(shù)為999,找出顯著影響(P<0.05)和極顯著影響(P<0.01)菌群結(jié)構(gòu)變化的環(huán)境因子;最后用Canodraw 4.5作圖,直觀(guān)展示相關(guān)性結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌群落的空間分布特征

對(duì)各點(diǎn)位細(xì)菌群落的監(jiān)測(cè)表明主要門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)等。其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)最豐富,5個(gè)位點(diǎn)的平均相對(duì)豐度達(dá)55.56%；其次是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，5個(gè)位點(diǎn)的平均相對(duì)豐度達(dá)16.84%,擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)平均相對(duì)豐度分別為11.97%和3.29%；其他含量較高的門(mén)類(lèi)包括酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、綠菌門(mén)(Chlorobi)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)等。

進(jìn)水中變形菌門(mén)相對(duì)豐度為56.74%,是最豐富的門(mén)類(lèi),從圖1可見(jiàn),主要有弓形桿菌屬(arcobacter，0.96%)和不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter，1.06%。厚壁菌門(mén)其次(18.46%),從具體種屬看,主要有葡萄球菌屬(turicibacter)、SMB53、互營(yíng)單孢菌屬(syntrophomonas)和消化鏈球菌屬(sedimentibacter),其含量分別為1.73%、0.67%、2.34%和3.02%。

圖1 養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)各位點(diǎn)細(xì)菌在屬分類(lèi)的相對(duì)豐度

生物處理后,變形菌門(mén)在出水中含量顯著下降,相對(duì)豐度為41.03%。弓形桿菌屬(Arcobacter)在出水中的豐度較高。類(lèi)似地,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的相對(duì)豐度同樣降至26.27%,擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度下降至8.19%?？赡苓@兩類(lèi)細(xì)菌主要在生物處理單元發(fā)揮降解污染物質(zhì)的功能,從而在出水中相對(duì)豐度降低。相比之下,放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)的相對(duì)豐度增至12.98%,鹽單孢菌屬(Halomonas)和分支桿菌屬(Mycobacterium)等在出水中的相對(duì)豐度較高。這可能是因?yàn)榉啪€(xiàn)菌門(mén)多為自養(yǎng)型,自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求不高,所以出水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降低,放線(xiàn)菌門(mén)的含量升高。

2.2 真菌群落的空間分布特征

養(yǎng)殖廢水系統(tǒng)各點(diǎn)位真菌共檢測(cè)到3個(gè)門(mén)、34個(gè)屬,分別為子囊菌門(mén)(Ascomycoka)(29.72%)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)(9.8%)和少量壺菌門(mén)(Chytridiomycota).其中相對(duì)豐度較高的屬有支頂孢屬(Acremonium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、馬拉色霉菌屬(Malassezia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、輪枝孢菌屬(Verticillium)、單端孢屬(Trichothecium)、分子孢子屬(Cladosporium)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)和盤(pán)二孢菌屬(Marssonina)等。

進(jìn)水中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度為39.12%,是最豐富的門(mén)類(lèi),其中念珠菌屬占20.63%，支頂孢屬占3.79%；擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度為18.75%,其中馬拉色霉菌屬占0.21%，紅酵母屬占2.40%，毛孢子菌屬占16.27%(圖2)。

圖2 養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)各位點(diǎn)真菌在屬分類(lèi)的相對(duì)豐度

活性污泥中真菌群落相比進(jìn)水發(fā)生顯著改變。子囊菌門(mén)仍為最主要的門(mén)類(lèi),但其含量在厭氧池和缺氧池中減少至22.27%,而在好氧池中其相對(duì)豐度上升至53.22%,這意味著在好氧池中有大量好氧真菌繁殖。值得注意的是,子囊菌門(mén)中曲霉菌屬(Aspergillus)在活性污泥中相對(duì)豐度為0.06%,據(jù)報(bào)道黃曲霉(aspergillusflavus)中的黃曲霉素對(duì)人體十分有害,少量可致死。從具體分布看,曲霉菌屬在厭氧池中的相對(duì)豐度尤為突出,幾乎是其他點(diǎn)位的2～3倍[27]。

另外,擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)中的毛孢子菌屬(Trichosporon)、馬拉色霉菌屬(Malassezia)在厭氧池和缺氧池中相對(duì)豐度很小,而在好氧池中分別達(dá)19.26%、5.61%,據(jù)報(bào)道上述菌屬可導(dǎo)致人畜皮膚病的感染。枝孢子菌屬(Cladosporium)在厭氧池和缺氧池中相對(duì)豐度較高，達(dá)2.23%,但在好氧池中幾乎無(wú)檢出。枝孢子菌屬(Cladosporium)會(huì)導(dǎo)致麥類(lèi)的黑變[28-29]。從真菌多樣性數(shù)據(jù)看,活性污泥S-H指數(shù)由進(jìn)水的5.252降至3.292,表明多樣性程度顯著降低。

生物處理后出水中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低至9.94%。同樣地,擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度降至4.17%。念珠菌屬、青霉菌屬、紅酵母屬等相對(duì)豐度也相應(yīng)降低。相比之下,小麥赤霉菌屬(Gibbrel)和盤(pán)二孢菌屬(Marssonina)在進(jìn)水和活性污泥中未檢出,而在出水中相對(duì)豐度分別為2.16%和0.95%,這意味著養(yǎng)殖廢水經(jīng)處理后可能產(chǎn)生新的真菌類(lèi)群,這可能和出水水質(zhì)條件變化有關(guān)。另外,出水中曲霉菌屬仍占0.34%～0.45%,馬拉色霉菌屬仍占1.22%～1.47%,青霉菌屬仍占0.93%～1.09%,毛孢子菌屬仍占1.52%～1.64%,這意味著養(yǎng)殖廢水中致病真菌可能排放到后續(xù)環(huán)境中，但目前國(guó)家暫未對(duì)水處理后致病菌的排放指標(biāo)嚴(yán)格規(guī)定。

綜合上述研究發(fā)現(xiàn),不同的廢水處理階段優(yōu)勢(shì)菌屬不盡相同。處理后出水中的細(xì)菌群落和活性污泥中具有明顯差異?；钚晕勰嗵幚韺?duì)禽畜養(yǎng)殖廢水中的致病菌有顯著的減量作用,但是并不能徹底去除或降低至相對(duì)可忽略的水平，尤其出水中仍可檢出幾種致病真菌,其對(duì)后續(xù)生態(tài)環(huán)境和公共健康的影響不容忽視。

2.3 污水水質(zhì)對(duì)養(yǎng)豬廢水處理系統(tǒng)細(xì)菌和真菌群落分布的影響

表1 各點(diǎn)位的水質(zhì)指標(biāo)值 mg/L

(a) 細(xì)菌

(b) 真菌

通過(guò)上述分析發(fā)現(xiàn),養(yǎng)豬污水的處理過(guò)程中眾多細(xì)菌和真菌群落的變化可能受水質(zhì)參數(shù)(主要是COD和氮)變化的明顯影響。對(duì)于養(yǎng)豬廢水處理,創(chuàng)造合理的生存條件,促進(jìn)微生物特別是功能菌的增殖,最大程度發(fā)揮降解有機(jī)物和脫除氮的功能,可能是提高其處理效果的有效途徑。

3 結(jié) 論

畜禽廢水處理廠(chǎng)活性污泥中具有極其豐富的生物多樣性,細(xì)菌域中變形菌門(mén)(55.56%)、厚壁菌門(mén)(16.84%)、擬桿菌門(mén)(11.97%)和放線(xiàn)菌門(mén)(3.29%)豐度較高。變形菌門(mén)為活性污泥中最主要的門(mén)類(lèi),經(jīng)生物處理后,弓形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌等的相對(duì)豐度大幅度下降。在出水中,厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度也有顯著降低。擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度同樣顯著下降。相比之下,放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度經(jīng)過(guò)生物處理后小幅增加,鹽單孢菌屬和分枝桿菌屬等的相對(duì)豐度在出水中相對(duì)較高。

在真菌域中子囊菌門(mén)(29.72%)、擔(dān)子菌門(mén)(9.8%)和壺菌門(mén)相對(duì)豐度較高。同時(shí)還在活性污泥中檢測(cè)到曲霉菌屬、葡萄球菌屬、馬拉色霉菌屬、盤(pán)二孢菌屬等能產(chǎn)生大量有害真菌的菌屬。生物處理后出水中子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低。念珠菌屬、青霉菌屬、馬拉色霉菌屬、毛孢子菌屬、紅酵母屬等相對(duì)豐度也相應(yīng)降低。同時(shí),在出水中還檢測(cè)出了新的菌屬，如小麥赤霉菌屬和盤(pán)二孢菌屬。從出水各個(gè)菌屬相對(duì)豐度看,活性污泥法處理養(yǎng)殖廢水并不徹底,曲霉菌屬、青霉菌屬、馬拉色霉菌屬等中的致病菌將隨著污水外排進(jìn)入到后續(xù)環(huán)境。加強(qiáng)畜禽養(yǎng)殖行業(yè)監(jiān)管、提高畜禽養(yǎng)殖廢水處理效率以最大程度降低養(yǎng)殖廢水環(huán)境和公共健康威脅刻不容緩。

[1]陳峻峰，顏智勇，邵繼海，等.金霉素對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧生物處理及細(xì)菌多樣性的影響[J].凈水技術(shù)，2014，33(2):76-80.(CHEN Junfeng，YAN Zhiyong，SHAO Jihai，et al.Effect of Chlortetracycline on bacterial diversity and anaerobic biological treatment for livestock wastewater[J].Water Purification Technology，2014，33(2):76-80.(in Chinese))

[2]段妮娜,董濱,何群彪,等.規(guī)?；B(yǎng)豬廢水處理模式現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J].凈水技術(shù),2008,27(4):9-15.(DUAN Nina，DONG Bin，HE Qunbiao，et al.Current status and advances in swine wastewater treatment technology for scaled hoggery[J].Water Purification Technology，2008,27(4):9-15.(in Chinese))

[3]童朝鋒，岳亮亮，郝嘉凌，等.南京市外秦淮河水質(zhì)模擬及引調(diào)水效果[J].水資源保護(hù)，2012，28(6):49-54.(TONG Chaofeng，YUE Liangliang，HAO Jialing,et al. Water quality simulation and water diversion effect analysis of external Qinhuai River in Nanjing [J].Water Resources Protection,2012，28(6):49-54.(in Chinese))

[4]張紅舉，甘升偉，袁洪州，等.環(huán)太湖河流入湖水質(zhì)控制濃度分析[J].水資源保護(hù)，2012，28(6):8-11.(ZHANG Hongju，GAN Shengwei,YUAN Hongzhou,et al.Analysis of controlled concentration of water quality of rivers around Taihu Lake [J].Water Resources Protection,2012，28(6):8-11.(in Chinese))

[5]高廷耀，顧國(guó)維,周琪.水污染控制工程(下冊(cè))[M].2版.北京:高等教育出版社，1999.

[6]余淦申.生物接觸氧化處理廢水[M].北京:環(huán)境科學(xué)出版社,1990.

[7]孟祥至，孟昭福，趙君楠,等.進(jìn)水氨氮濃度對(duì)SBR法處理豬場(chǎng)廢水的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013,32(8):1656-1663.(MENG Xiangzhi，MENG Zhaofu，ZHAO Junnan，et al.Effect of influent concentrations of ammoniacal nitrogen on SBR treatment for swine wastewater[J].Journal of Agro-Environment Science，2013,32(8):1656-1663.(in Chinese))

[8]ESTRADA-ARRIAGA E B，RAMIREZ-CAMPEROS E，MOELLER-CHAVEZ G E，et al.Anaerobic/aerobic treatment of a petrochemical wastewater from two aromatic transformation processes by fluidized bed reactors[J].Water Science & Technology，2012，66(12):2754-2763.

[9]區(qū)岳州.氧化溝污水處理技術(shù)及工程實(shí)例[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[10]LIDONG S，ANHUI H，RENCUN J，et al.Enrichment of anammox bacteria from three sludge sources for the startup of monosodium glutamate industrial wastewater treatment system[J].Journal of Hazardous Materials，2012，199/200(2):193-199.

[11]WAKI M，YASUDA T，SUZUKI K，et al.Rate determination and distribution of anammox activity in activated sludge treating swine wastewater[J].Bioresource Technology，2010，101(8):2685-90.

[12]操家順，陸曉光，方芳.浸沒(méi)式超濾膜用于污水處理廠(chǎng)深度處理的試驗(yàn)[J].水資源保護(hù)，2013,29(3):61-65.(CAO Jiashun,LU Xiaoguang,FANG Fang.A pilot study on submerged ultrafiltration membrane for advanced treatment of wastewater in wastewater treatment PLANTS[J].Water Resources Protection，2013,29(3):61-65.(IN CHINESE))

[13]馬牧源,崔麗娟,張曼胤,等.白洋淀養(yǎng)鴨廢水水質(zhì)組成及其擴(kuò)散和消減特征[J].水資源保護(hù),2017,33(5):145-153.(MA Muyuan,CUI Lijuan,ZHANG Manyin，et al.Water quality composition of duck farm wastewater in Baiyangdian Lake and its diffusion and reduction characteristics[J].Water Resources Protection，2017,33(5):145-153.(in Chinese))

[14]LUND M，MADSEN M.Strategies for the inclusion of an internal amplification control in conventional and real time PCR detection of Campylobacter spp in chicken fecal samples[J].Molecular & Cellular Probes，2006，20(2):92-99.

[15]KUROWSKI P B，TRAUB-DARGATZ J L，MORLEY P S，et al.Detection of Salmonella spp in fecal specimens by use of real-time polymerase chain reaction assay[J].American Journal of Veterinary Research，2002，63(9):1265-1268.

[16]SABET N S，SUBRAMANIAM G，NAVARATNAM P，et al.Detection of methicillin and aminoglycoside-resistant genes and simultaneous identification of S.aureus using triplex real-time PCR Taqman assay[J].Journal of Microbiological Methods，2007，68(1):157-162.

[17]YUAN Q，GUO M，YANG J，et al.The sludge loading rate regulates the growth and release of heterotrophic bacteria resistant to six types of antibiotics in wastewater activated sludge[J].Environmental Science:Processes & Impacts，2014，17(1):206-212.

[18]LIAWR B,CHENG M P,WU M C,et al.Use of metagenomicapproaches to isolate lipolytic genes from activated sludge[J].Bioresource Technology,2010,101(21):8323-8329.

[19]GARCIAARMISEN T，ANZIL A，CORNELIS P，et al.Identification of antimicrobial resistant bacteria in rivers:insights into the cultivation bias[J].Water Research，2013，47(14):4938-4947.

[20]賀紀(jì)正，張麗梅，沈菊培,等.宏基因組學(xué)(Metagenomics)的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(2):209-218.(HE Jizheng，ZHANG Limei，SHEN Jupei，et al.Advances and perspectives of Metagenomics[J].Acta Scientiae Circumstantiae，2008，28(2):209-218.(in Chinese))

[21]MARDIS E R.A decade’s perspective on DNA sequencing technology[J].Nature，2011，470:198-203.

[22]NEAFSEY D E，HAAS B J.‘Next-generation’ sequencing becomes ‘now-generation’[J].Genome Biology，2011，12(3):1-3.

[23]QIN J，LI R，RAES J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature，2010，464:59-65.

[24]METCALF W W，GRIFFIN B M，CICCHILLO R M，et al.Synthesis of methylphosphonic acid by marine microbes:a source for methane in the aerobic ocean[J].Science，2012，337:1104-1107.

[25]MACKELPRANG R，WALDROP M P，DEANGELIS K M，et al.Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw[J].Nature，2011，480:368-371.

[26]WARNECKE F，LUGINBüHL P，IVANOVA N，et al.Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite[J].Nature，2007，450:560-565.

[27]安虹，鄒廣迅.黃曲霉素毒性效應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(24):15007-15009.(AN Hong，ZOU Guangxun.Research progress of toxicological effects and mechanism of aflatoxin[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2011，39(24):15007-15009.(in Chinese))

[28]熊琳，冉玉平，周光平.馬拉色菌屬的分類(lèi)及其在幾種皮膚病的分布情況[J].中華皮膚科雜志，2000，33(5):318-320.(XIONG Lin，RAN Yuping，ZHOU Guangping.Study on taxonomy of the genus Malassezia and the distribution of it in some dermatoses[J].Chinese Journal of Dermatoses，2000，33(5):318-320.(in Chinese))

[29]龔弘強(qiáng).西藏地區(qū)青稞籽粒鐮孢屬真菌及其致病性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

[30]于洋，王曉燕，張鵬飛.北運(yùn)河水體浮游細(xì)菌群落的空間分布特征及其與水質(zhì)的關(guān)系[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào).2012,7(3):337-344.(YU Yang，WANG Xiaoyan，ZHANG Pengfei.Spatial distribution of planktonic bacterial community and its relationship to water quality in Beiyun River[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2012,7(3):337-344.(in Chinese))

[31]吳霞，謝悅波.直接投菌法在城市重污染河流治理中的應(yīng)用研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2014,8(8):3331-3336.(WU Xia，XIE Yuebo.Application of directly adding microbial agent to improve water quality of heavily polluted urban river[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2014,8(8):3331-3336.(in Chinese))

[32]王亮.規(guī)?；i場(chǎng)養(yǎng)殖廢水高效脫氮除磷技術(shù)探究[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.