羅 曉,鄭向陽,趙叢叢,張立國,鐘為章 (1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,河北 石家莊 050018；.河北科技大學(xué)建筑工程學(xué)院,河北 石家莊 050018；.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 00006)

傳統(tǒng)脫氮工藝是通過氨化、硝化和亞硝化、反硝化細(xì)菌的同化作用,經(jīng)由有機(jī)氮化合物→NH4+-N→NO2-→NO3-→N2和有機(jī)氮化合物→NH4+-N→ NO2-→N2過程完成脫氮[1].目前脫氮工藝關(guān)注點由脫氮機(jī)理[2]、運行參數(shù)的控制[3]以及多種脫氮工藝耦合設(shè)計[4]逐漸轉(zhuǎn)向了脫氮功能微生物的研究[5].但由于微生物培養(yǎng)條件復(fù)雜,僅有 1%～1.5%的微生物為可培養(yǎng)生物,所以采用傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)難以說明低豐度微生物及群落結(jié)構(gòu)間的相互關(guān)系,無法用于分析污水處理工藝操作參數(shù)與脫氮微生物菌群特征之間的相互關(guān)系[6].

基于16s rDNA的高通量測序技術(shù)為揭示脫氮功能菌群及群落多樣性提供了有力的手段[7].相關(guān)學(xué)者對不同處理工藝、溫度、溶解氧濃度下的脫氮效果與微生物群落結(jié)構(gòu)均有所研究[8-10].李鵬等[11]、竇娜莎等[12]、李志靜等[13]研究發(fā)現(xiàn),變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為多種水處理工藝的主要菌門,同時,提高進(jìn)水溫度,控制氧氣、NH4+-N濃度等,對微生物群落結(jié)構(gòu)的相對豐度比例產(chǎn)生重要影響,從而影響水質(zhì)處理效果.除去水處理工藝、溫度、溶解氧、及NH4+-N濃度外,污泥濃度(MLSS)也是影響水處理效果的重要因素之一,有學(xué)者認(rèn)為,提高M(jìn)LSS可提高反硝化速率和脫氮效率[14],但 COD受其影響較小[15].辛海霞等[16]利用布生物反應(yīng)器(FBR)處理高氨氮廢水時發(fā)現(xiàn),當(dāng)污泥濃度小于6500mg/L時, NH4+-N去除率由 91.53%升至 95.85%,污泥濃度繼續(xù)增加,NH4+-N去除率迅速下降,但是污泥濃度的高低致使微生物結(jié)構(gòu)及功能代謝產(chǎn)生哪些差異,影響脫氮效果,相關(guān)報道相對較少.

因此,本文以平行運行的兩組A/O工藝為出發(fā)點,結(jié)合其進(jìn)出水水質(zhì),研究污泥濃度對脫氮性能的影響;利用 Illumina MiSeq測序技術(shù),解析兩組A/O池體中微生物群落構(gòu)成及多樣性,并確定優(yōu)勢脫氮菌群與水質(zhì)、污泥濃度的相關(guān)性;同時通過生物信息學(xué)手段,考察兩組池體中功能基因、代謝通路的差異,為優(yōu)化A/O工藝提供技術(shù)支持與理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

污泥樣品取自河北省某化工企業(yè)污水處理站,設(shè)計水量 15000m3/d,該站進(jìn)水主要有 3個來源：淀粉廠區(qū)廢水、維生素B12廠區(qū)廢水和企業(yè)內(nèi)部生活污水,其中生活污水量僅占總水量的 8%.該站主體工藝為多組改良型A/O工藝,進(jìn)水COD和NH4+-N平均濃度分別為500mg/L和450mg/L,水質(zhì)監(jiān)測時間為3月4日至4月25日.水質(zhì)處理效果穩(wěn)定后,于第15d分別從兩組A/O工藝池中取活性污泥樣品,1號池兩個：A1、O1,2號池 2個：A2、O2,且 1、2號池 MLSS 分別為 4066,2985mg/L.取樣置于冰桶中運回實驗室,離心(5min,11000r/min)后稱取5g,冷凍于-80℃冰箱中,準(zhǔn)備DNA提取.

1.2 污泥DNA提取及PCR擴(kuò)增

DNA 提取采用 PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒(Mobio),按照試劑盒流程提取 DNA,并進(jìn)行DNA濃度、純度及完整性檢測.DNA濃度及純度檢測利用Genesys 10s紫外可見分光光度計(Thermo),依據(jù)其在260nm和280nm之間吸光率比率值(1.80～2.0之間)及在260nm和230nm吸光率比率值(高于1.70)進(jìn)行判斷.DNA完整性利用2%TAE稀釋溶液、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)觀察條帶完整性,電泳時間45min,電壓90V.

對提取到的DNA的16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增.以所提取的各樣品 DNA為模版,反應(yīng)體系為30μL,選 用 通 用 上 游 引 物 為 EUb341f：5’-cctacgggaggcagcag-3’下游引物為 Eub907r：5’-ccgtcaattcctttgagt tt-3’.其中向PCR擴(kuò)增管中添加DNA 模板 0.5μL,正反向引物各 0.6μL,滅菌水22.4μL,dNTP2.4μL,3μL 緩沖液,ExTaq 酶 0.5μL.擴(kuò)增結(jié)束后,運用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測,使用Axyprep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收DNA.PCR擴(kuò)增后的條帶亮度明顯,位置清晰,可直接用于后續(xù)測序分析.委托北京理化分析測試中心進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序.

1.3 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)測定

遵循國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定 NH4+-N、NO3--N和 NO2--N等常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)[17],利用重量法測定MLSS.

1.4 Miseq測序及生物學(xué)分析

本研究采用Illumina MiSeq PE2 × 125方法進(jìn)行測序.測序數(shù)據(jù)下機(jī)后(Raw reads),根據(jù)Barcode拆分不同樣本數(shù)據(jù),并去除Barcode序列及引物序列.采用FLASH拼接Miseq原始數(shù)據(jù),拼接成功率控制在 90%以上[18].利用 MOTHUR去除含 N的序列及低質(zhì)量序列[19],利用Usearch7.1軟件對獲得的高質(zhì)量序列操作分類單元(OTU),OTU中序列之間的相似性設(shè)定為97%[20],并將獲得的OTU與SILVA(Realease123,www.arb-silva.de)非冗余度0.9的16S序列數(shù)據(jù)庫比對,獲得各OTU代表序列的分類信息.

使用 MOTHUR軟件計算各個樣本 Alpha多樣性指標(biāo),以反映本次測序深度、物種均勻性等;使用R軟件對樣本繪制heatmap并分析;使用PICRUST軟件[21]完成本次測序功能分析,通過自編腳本程序?qū)⑺@得序列對比Greengenes數(shù)據(jù)庫(gg_13_5版本),參考序列最近鄰居,尋找親緣關(guān)系最近祖先并預(yù)測樣品中除16S的其它基因片段,獲得本次 A/O工藝各工段功能基因計數(shù),從而實現(xiàn)對池體中微生物群落的代謝功能分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 MLSS對脫氮性能的影響

圖1 NH4+-N去除率Fig.1 The scatter plot of ammonia nitrogen removal effect

由圖 1、表 1可見,當(dāng) MLSS為 2985mg/L時,NH4+-N去除率較低,A池NH4+-N平均去除率僅為57.97%,O池NH4+-N平均去除率為23.27%,最終出水濃度為 147.47mg/L,當(dāng) MLSS升高至4066mg/L,A池NH4+-N平均去除率為 80.78%,平均出水濃度78.44mg/L,O池NH4+-N平均去除率為 51.81%,最終出水濃度為 40.19mg/L.其中NO3--N和NO2--N濃度在1號池A池、O池中均高于2號池,反映出1號池中硝化菌及亞硝化菌數(shù)量較多,硝化作用及亞硝化作用強烈,NH4+-N 濃度較低,反硝化作用強烈.在相同運行條件下,MLSS的高低對A/O工藝脫氮性能有著顯著影響.因此,在處理高濃度 NH4+-N 廢水時,MLSS可適當(dāng)調(diào)高即污泥停留時間(SRT)適當(dāng)延長,但MLSS過高則會引起微生物內(nèi)源呼吸,產(chǎn)生 SMP積累,抑制硝化菌生長代謝,從而影響NH4+-N 去除效果[22]. Kawasaki等[23]研究發(fā)現(xiàn),MLSS較低時,有機(jī)物不能被完全降解,當(dāng) MLSS維持在3000～5000mg/L時,處理效果穩(wěn)定.

表1 NH4+-N、NO3--N和NO2--N平均濃度(mg/L)Table 1 The average concentration of NH4+-N,NO3--N and NO2--N(mg/L)

2.2 微生物多樣性分析

經(jīng)PCR和高通量測序后,4個污泥樣品(A1、O1、A2、O2)獲得有效序列數(shù)在70275～273582之間.為了解析活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)豐富度,在 97%的相似度水平對有效序列歸類OTU 并統(tǒng)計各樣本的 α-多樣性指數(shù)見表 2.各樣本 OTU 數(shù)量在 3929～8027之間,分別為：6022(A1)、3929(O1)、6151(A2)和 8027(O2)OTUs.各樣品覆蓋率均在 97%以上,說明本次測序可以覆蓋群落的多樣性,污泥中大多數(shù)微生物均已被檢測出來.

Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)表示微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)越高,表明群落豐富度越高,Shannon指數(shù)越高,群落物種的多樣性越高[24].表 2顯示,2號池的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均較高,即2號池的物種豐度和多樣性均高于1號池.其原因可能為1號池中污泥量較高,微生物的死亡-再生現(xiàn)象加劇,提供了更多反硝化碳源[25],使得脫氮效率提高,NH4+-N濃度降低,具有脫氮性能的微生物群落結(jié)構(gòu)增殖迅速,使得樣本多樣性和豐度降低.

表2 4個樣品中細(xì)菌群落指數(shù)Table 2 Species abundance and diversity of 4samples

2.3 微生物菌群分布特點

基于SILVA數(shù)據(jù)庫的分類信息,對1、2號池樣品測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了門、綱和屬水平上的分類及分析.如圖2所示,在門水平,4個樣品共檢測出55個菌門.A1和O1樣品中變形菌門Proteobacteria為優(yōu)勢菌,豐度分別為 41.28%和 40.02%,其次是Bacteroidetes(24.69%和 25.82%)、Chloroflexi(7.74%和 7.95)、Firmicutes(7.73%和 7.3%)和Chlorobi(2.93%和 2.74%).A2和 O2樣品中Bacteroidetes為優(yōu)勢菌,豐度分別為 33.78%和32.77%,其次是Proteobacteria(29.48%和31.08%).此 外 Chloroflexi、Firmicutes、Chlorobi、Actinobacteria、Candidate division TM7、Verrucomicrobia、Acidobacteria和 Candidate division OD1(相對豐度＞1%)也是 A2、O2 樣品中的主要門類.結(jié)果表明,1號和2號池體中微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度上差異較小.但在污水處理發(fā)揮脫氮除磷、降解多種污染物作用的的變形菌門(Proteobacteria)[26]含量不盡相同,差異明顯,在NH4+-N處理效果較好的 A1、O1中,含量較高,分別為41.28%和40.02%,而脫氮性能較差的A2、O2中含量較低,分別為29.48%和31.08%.兩池體中最優(yōu)勢菌門分別為 Proteobacteria(1號池)和Bacteroidetes(2號池).2號池體中在門一水平類群較為多樣,且受到污泥回流影響,各池體中缺氧段和好氧段的微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度差異不大,這與以往很多研究結(jié)論一致.宋云龍等[27]研究發(fā)現(xiàn),在A/O工藝中式裝置中,缺氧段和好氧段優(yōu)勢微生物種類相同且Proteobacteria、Actinobacteria Bacteroidetes、Planctomycetes 、Acidobacteria等優(yōu)勢菌群相對豐度比例差異僅為1%～3%.

由表 3可知,所選 4個樣品中 β-變形菌綱(β-Proteobacteria)是變形菌門中豐度最大的菌群,其在1號池體和2號池體中比例分別約占20%和12%.而β-Proteobacteria也是在脫氮除磷中發(fā)揮重要作用的菌群,其菌綱中的某些細(xì)菌與污泥反硝化有關(guān)[28].1號池 α-Proteobacteria和 γ-Proteobacteria的相對豐度均高于 2號池.δ-Proteobacteria和ε-Proteobacteria相對豐度兩池體相近,且ε-Proteobacteria總體豐度最低.

表3 變形菌門(Proteobacteria)各綱分布Table 3 The distribution of classes of Proteobacteria

本次研究與先前研究結(jié)果相似.Hu等[29]通過454焦磷酸鹽測序技術(shù)研究12座污水處理廠后發(fā)現(xiàn),變形菌門尤其是β-Proteobacteria在各污水場中在門和綱級別相對豐度比例分別最高,而Ye 等[30]通過實驗室裝置研究得出,α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、ε-Proteobacteria等在硝酸鹽還原過程中發(fā)揮了重要作用.

屬分類水平上,1號池體和 2號池體微生物群落結(jié)構(gòu)如圖 3所示.其中,1號主要菌屬為Thauera、Stenotrophomonas和Sphingomonas,其豐度分別為 13.99%、3.87%、3.55%(A1)和12.15%、3.67%、2.76(O1).其中,隸屬于 β-變形菌(β-Proteobacteria)的陶厄氏菌屬(Thauera)為最主要的反硝化脫氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解過程起了十分重要的作用[31-32].此外,A1、O1樣品中的主要類群還包括Blautia、Lactobacillus、Sandaracinus和Bacillus等(相對豐度＞1%).與 1號池相比,2號池中主要屬類為Thauera、Stenotrophomonas、Sphingomonas、Blautia和Lactobacillus(相對豐度＞1%)等菌屬,在兩池體差異較為明顯的菌屬為陶厄氏菌屬Thauera,分別為 13.07%(1號池)和 5.78%(2號池),Sandaracinus,分別為 1.33%(1號池)和0.37%(2號池),同時,同一池體缺氧段好氧段菌屬豐度比例差異不大.

圖2 門水平下微生物群落相對豐度Fig.2 Relative abundance of phylum in all samples

所取各樣品中氨氧化菌(AOB)與亞硝酸鹽氧化菌(NOB)種類一致,AOB包含亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化球菌屬(Nitrosococcus),其中相對豐度比例較高者為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),該菌廣泛存在于水、土壤中,是能氧化氨為亞硝酸的化能自養(yǎng)細(xì)菌[33].NOB 包含Candidatus Nitrotoga和硝化螺菌屬(Nitrospira).1號池AOB和NOB相對豐度分別為0.583%和0.476%,2號池 AOB和 NOB相對豐度分別為 0.355%和0.376%.1號池中AOB、NOB相對豐度比例均高于2號池,NH4+-N代謝效果優(yōu)于2號池.AOB、NOB含量在各池體中相對豐度均低于 1%,但不影響其高效脫氮.Ye等[30]和Ma等[34]的研究均表明,活性污泥中AOB和NOB相對豐度比例處于0.01%～1%的條件下,在焦化廢水處理廠和實驗室裝置中均能達(dá)到高效脫氮.

圖3 屬水平下微生物群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of genus in all samples

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在屬的水平對樣品及其所含菌屬進(jìn)行聚類分析,并根據(jù)各樣品中不同OUT所含豐度繪制熱圖(heatmap),以反映在菌屬水平上聚類差異及群落結(jié)構(gòu)差異性,如圖4所示.

從總體來看,與A2、O2相比,A1、O1之間群落結(jié)構(gòu)和豐度差異均比較大.這說明當(dāng) A/O工藝MLSS較高時,微生物活性增加,使得缺氧段與好氧段各池體特定功能菌群代謝旺盛.結(jié)合非加權(quán)UniFrac距離可知(表4),對比缺氧段A1和A2、好氧段O1和O2可發(fā)現(xiàn),群落結(jié)構(gòu)在好氧段具有明顯差異,MLSS對于好氧段作用強于缺氧段.

由圖 4可知,各樣品微生物熱圖可劃分為 4個Cluster.菌屬的豐度受到了MLSS的影響,其中1、2號池中菌群變化較為明顯的從屬于Cluster 1和 Cluster 4.Cluster 1主要包括Peritrichia、OPB35soil group uncultured和Sphingobacteriales等,Cluster 4主要包括 Thauera 2、Hyphomonadaceae uncultured、Saprospiraceaeuncultured 1和Cytophagaceaeuncultured.Cluster 1和Cluster 4中大部分菌群屬于硝化菌、反硝化菌,并且Thauera和Saprospiraceaeuncultured 1等為優(yōu)勢菌群,其在脫氮過程中發(fā)揮了重要作用[35].

圖4 屬水平的前50個物種相對豐度熱圖Fig.4 Heatmap tree based on the relative abundance of top 50genus in all samples

表4 4個樣品非加權(quán)UniFrac距離Table 4 Unweighted unifrac distance between 4samples

2.5 不同池體活性污泥的功能分析

基于宏基因組測序的物種信息,通過PICRUST軟件與KEGG基因數(shù)據(jù)庫(京都基因與基因組百科全書)和通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析,預(yù)測各樣品功能基因組成[36].在第一層級的功能基因分類中,兩組 A/O工藝中功能基因排序相同,主要分為細(xì)胞過程(Cellular Processes)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、人類疾病(Human Diseases)、代謝機(jī)制(Metabolism)、無(None)、生物系統(tǒng)(Organismal Systems)和未分類(Unclassified)等 8類.豐度最高的功能基因是代謝機(jī)制相關(guān)基因(1號池50.08%, 2號池 50.05%),其次是與遺傳信息處理(1號池16.59%,2號池 16.91%)、環(huán)境信息處理(1號池13.41%,2號池13.38%)、細(xì)胞過程(1號池3.84%,2號池3.78%)、人類疾病相關(guān)基因(1號池1.06%,2號池 1.01%)、有機(jī)系統(tǒng)(1號池 0.83%,2號池0.81%)、未明確分類及無功能基因序列(1號池14.17%,2號池14.04%),除去遺傳信息處理相關(guān)基因在1號池中含量略低,其余均在1號池中含量高.

在KEGG子類中,各類代謝相關(guān)基因如圖5所示,膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因是兩種污泥功能基因中最大的類群(1號池11.10%,2號池11.18%).其次是氨基酸代謝相關(guān)基因(1號池 10.49%,2號池10.48%)和碳水化合物代謝相關(guān)基因(1號池10.27%,2號池 10.32%).隨后是復(fù)制和修復(fù)(1號池7.40%,2號池7.38%)、能量代謝(1號池5.91%,2號池5.94%)、未識別基因(1號池5.09%,2號池5.10%)、翻譯(1號池4.73%,2號池4.73%)、輔助因子和維生素代謝相關(guān)基因(1號池4.25%,2號池4.25%)等.這8類KEGG子類群在兩組池體中的排序是相同的.其中,2號池中關(guān)于細(xì)胞通訊(Cell Communication)和感覺系統(tǒng)(Sensory System)功能基因含量明顯高于1號池.

圖5 兩組池體功能基因分類的相對比例(Level 2)Fig.5 Relative proportions of functional classification in different tanks (Level 2)

脫氮效果是考量A/O工藝是否正常運行的重要指標(biāo)之一,氮代謝基因廣泛分布于 A/O工藝的污泥系統(tǒng)中.根據(jù)本次測序結(jié)果,結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫,得到參與氮循環(huán)的基因序列(硝化、反硝化、氨化及固氮過程),篩選出并進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計歸類,得到氮代謝途徑及各類基因數(shù)量,如圖 6所示.結(jié)果顯示,反硝化相關(guān)的功能基因序列在 1、2號池體中相對含量較高.其次是氨化、硝化和固氮相關(guān)功能基因.反硝化與氨化功能基因序列占優(yōu)勢地位,與田美等[37]及Yu等[38]的研究保持一致.除了EC1.7.99.6編碼氧化亞氮還原酶、EC1.18.6.1編碼固氮酶和EC1.7.3.4編碼硝化酶的基因在 2號池(0.017%,0.023%,0.0045%)中相對含量高于 1號池(0.015,0.017%,0.0062%),其余編碼硝化酶、反硝化酶和氨化酶的基因均在1號池中相對含量高,其中編碼硝酸還原酶EC1.7.99.4基因含量最高.結(jié)合池體實際運行效果得知,編碼反硝化酶和編碼氨化酶的功能基因為影響該工藝處理效果的主要因素.

圖6 兩組池體參與氮循環(huán)關(guān)鍵酶的相對豐度Fig.6 Abundance of nitrogen cycle related key enzymes in the two tanks

3 結(jié)論

3.1 1號池和2號池進(jìn)水水質(zhì)相同,當(dāng)MLSS分別為4066mg/L和2985mg/L時,其NH4+-N平均去除率分別為90.2%和67.2%.

3.2 兩池體中微生物多樣性差異不大,其優(yōu)勢菌門均為變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門,平均總相對豐度比例占到 81.09%以上;其中的A、O池微生物群落也不存在顯著性差異.

3.3 在功能基因?qū)用?兩池體KEGG所有8個類別排序相同,氮代謝相關(guān)基因中,硝化酶、反硝化酶和氨化酶的相關(guān)功能基因在 1號池中含量均較高.

3.4 MLSS對A/O工藝脫氮效果有著重要影響,但過高也容易造成基質(zhì)不足,影響微生物活性,為實現(xiàn)最佳脫氮效果,MLSS宜控制在4000mg/L左右.

[1]龔靈瀟.缺氧/好氧生物膜工藝處理低碳氮比生活污水的脫氮特性 [D]. 北京：北京工業(yè)大學(xué), 2013.

[2]成官文,吳志超,黃翔峰,等.沸石強化 A/O生物脫氮工藝氨氮去除機(jī)理研究 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2010,4(3)：540-546.

[3]張鵬娟.A/O生物脫氮工藝影響因素及強化運行效果的試驗研究 [D]. 鄭州：鄭州大學(xué), 2013.

[4]徐崢勇.基于亞硝化、厭氧氨氧化與反硝化的脫氮耦合工藝及其控制策略研究 [D]. 長沙：湖南大學(xué), 2011.

[5]趙繼紅,樓 燕,余志晟,等.城市污水廠(A/O工藝)微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化 [J].生態(tài)環(huán)境, 2008,17(3)：898-902.

[6]Wintzingerode F V, G?bel U B, Stackebrandt E. Determination of microbial diversity in environmental samples： Pitfalls of PCR-based rRNA analysis [J]. FEMS Microbiology Reviews,1997,21(3)：213-229.

[7]王紹祥,楊洲祥,孫 真,等.高通量測序技術(shù)在水環(huán)境微生物群落多樣性中的應(yīng)用 [J]. 化學(xué)通報, 2014,(3)：196-203.

[8]孫豆豆.強化 A/O工藝低溫脫氮效能與菌群特性研究 [D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2015.

[9]趙文莉.復(fù)合碳源填料深度反硝化脫氮特性研究 [D]. 北京：北京工業(yè)大學(xué), 2015.

[10]戶海燕,瞿思宜,張正哲,等.分子生物技術(shù)在厭氧氨氧化工藝研究中的應(yīng)用 [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2016,(1)：20-26+43.

[11]李 鵬,畢學(xué)軍,王 軍,等.常規(guī)和倒置A2/O工藝活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的比較 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2017,37(3)：1137-1145.

[12]竇娜莎,王 琳.不同溫度下曝氣生物濾池運行效能與微生物群落結(jié)構(gòu) [J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2016,10(6)：2800-2806.

[13]李志靜,孫寶盛,張笑雪,等.不同供氧策略和氨氮濃度下SBR中微生物群落的演變 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2017,11(1)：359-365.

[14]Plósz B G, Jobbágy A, Jr G C. Factors influencing deterioration of denitrification by oxygen entering an anoxic reactor through the surface [J]. Water Research, 2003,37(4)：853-863.

[15]鄧仁健,張金松,曲志軍.污泥濃度對雙重后置反硝化工藝脫氮除磷的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2014,27(7)：797-803.

[16]辛海霞,季誠昌,張 凡,等.MLSS對FBR處理高氨氮印染廢水的影響 [J]. 東華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015,41(5)：692-695.

[17]國家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測分析方法 [M]. 4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002：258-281.

[18]Tanja M, Steven L. FLASH： fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies [J]. Bioinformatics, 2011,27(21)：2957-2936.

[19]Patrick D S, Sarah L W, Thomas R, et al. Introducing mothur：Open-Source, Platform-Independent, Community-Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2009,75(23)：7537-7541.

[20]Robert C Edgar. UPARSE： highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads [J]. Nature Methods, 2013,10(10)：996-998.

[21]Langille M G, Zaneveld J, Caporaso J G, et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S r RNA marker gene sequences [J]. Nature Biotechnology, 2013,31(9)：814-821.

[22]封 莉,張立秋,呂炳南.污泥濃度對膜生物反應(yīng)器運行特性的影響研究 [J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003,35(3)：307-310.

[23]Kawasaki K, Maruoka S, Katagami R, et al. Effect of initial MLSS, on operation of submerged membrane activated sludge process [J]. Desalination, 2011,281(20)：334-339.

[24]張恩華,戴幼芬,肖 勇,等.還原 Cr(Ⅵ)的混菌胞外聚合物和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2017,37(1)：352-357.

[25]Chung C M, Cho K W, Kim Y J, et al. Enhanced biological nitrogen removal in MLE combined with post-denitrification process and EF clarifier [J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2012,35(4)：503-511.

[26]Yang X, Zhou N, Chen M, et al. Analysis of microbial community structure in MBR with different ammonia concentrations using fluorescence in situ hybridization [J]. Journal of Southeast University： Nature Science Edition, 2013,43(2)：380-385.

[27]宋云龍,張金松,朱 佳,等.基于高通量測序的微生物強化污泥減量工藝中微生物群落解析 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(7)：2099-2107.

[28]黃 菲,梅曉潔,王志偉,等.冬季低溫下 MBR與 CAS工藝運行及微生物群落特征 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2014,35(3)：1002-1008.

[29]Hu M, Wang X H, Wen X H, et al. Microbial community structures in different wastewater treatment plants as revealed by 454-pyrosequencing analysis [J]. Bioresource Technology,2012,117(10)：72-79.

[30]Ye L., Shao M.F., Zhang T, et al. Analysis of the bacterial community in a laboratory-scale nitri fi cation reactor and a wastewater treatment plant by 454-pyrosequencing [J]. Water Research, 2011,45(15)：4390—4398.

[31]李衛(wèi)華,孫英杰,劉子梁,等.序批式生物反應(yīng)器填埋場脫氮微生物多樣性分析 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2016,37(1)：342-349.

[32]楊 華,黃 鈞,趙永貴,等.陶厄氏菌Thauera sp. strain TN9的鑒定及特性 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2013,19(2)：318-323.

[33]陳亞平,葉 宏,王 娟,等.亞硝化單胞菌的分離鑒定及其降解特性的研究 [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2007,30(9)：24-25.

[34]Ma Q, Qu Y Y, Shen W L, et al. Bacterial community compositions of coking wastewater treatment plants in steel industry revealed by Illumina high-throughput sequencing [J].Bioresource Technology, 2015,179：436-443.

[35]李 哿.活性污泥—生物膜復(fù)合系統(tǒng)脫氮除磷試驗研究 [D].濟(jì)南：山東建筑大學(xué), 2011.

[36]Ning L, Jin H, Han Y, et al. Pathways in bacterial and archaeal communities dictated by ammonium stress in a high solid anaerobic digester with dewatered sludge [J]. Bioresource Technology, 2017,241：95-102.

[37]田 美,劉漢湖,申 欣,等.百樂克(BIOLAK)活性污泥宏基因組的生物多樣性及功能分析 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2015,36(5)：1739-1748.

[38]Yu K, Zhang T. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of microbial community structure and gene expression of activated sludge [J]. Plos One, 2012,7(5)：e38183.