,麗然,,,,3, ,，*

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007；3.多多藥業(yè)有限公司,黑龍江佳木斯 154007)

眾所周知硒是人和動物不可缺少的微量元素[1],研究發(fā)現(xiàn)硒與許多疾病有關(guān),如大骨節(jié)病、白內(nèi)障、肝病、癌癥等。因硒可以保護(hù)肝臟、心臟等免受損傷,近年來愈來愈受關(guān)注[2-4]。據(jù)資料顯示肝病患者普遍缺硒,病情愈重,缺硒愈明顯[5]。而適宜補(bǔ)硒可以提高肝病患者的免疫力和抗氧化能力,以便達(dá)到保護(hù)肝臟、預(yù)防肝病的發(fā)生[6]。目前,中國營養(yǎng)學(xué)會推薦成人應(yīng)每天攝取50～250 μg的硒來保證身體健康,并呼吁人們應(yīng)該像每天攝取淀粉、蛋白質(zhì)一樣,每天也必須攝取適量的硒[3,7]。因此開發(fā)硒源顯得尤為重要。有報道納米硒是目前為止最安全且生物活性最高的硒形式[8-10],納米硒作為補(bǔ)硒劑已顯示出較強(qiáng)的優(yōu)勢,而制備納米硒的方法最常用的是模板法,該方法簡單,易操作,且制備的納米硒穩(wěn)定。如高義霞等以刺槐豆多糖為軟模板制備出紅色球形納米硒[11],楊夢濤用牡蠣多糖為模板制備了納米硒-牡蠣多糖[12]。由于使用的模板不同制備出的納米硒的尺寸也有所不同,其生物活性差異較大。有關(guān)納米硒生物活性的研究大都集中在免疫和抗氧化能力[13-14]、抗腫瘤細(xì)胞[15]、動植物補(bǔ)硒[16-17]等方面,而對其保肝作用的研究甚少,為了探究納米硒的保肝作用,本文選擇了一種沒有細(xì)胞毒性,不影響細(xì)胞正常功能的桔梗多糖為模板[18],在溫和的條件下制備具有一定尺度的納米硒桔梗多糖復(fù)合物,用CCl4制備小鼠化學(xué)肝損傷模型,通過測定小鼠血清與組織中各項生理指標(biāo)和肝組織染色,評價納米硒復(fù)合物的保肝作用,旨在為開發(fā)硒源、肝病的預(yù)防與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

昆明種小鼠170只(18～22 g,雄性) 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部,許可證號:SCXK(黑)2013-001，飼養(yǎng)條件:溫度保持在21～24 ℃之間,相對濕度在45%～50%之間,風(fēng)速為0.1～0.2 m/s,氣流≥30次/h；CCl4天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;聯(lián)苯雙酯滴丸 北京協(xié)和藥廠;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)及總蛋白(TP)檢測試劑盒 日本和光純藥工業(yè)株式會社;丙二醛(MDA)試劑盒和還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所;牛血清蛋白 美國Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)G-250 北京亞米生物科技有限公司;其他試劑均為分析純;桔梗 安國振宇中藥材飲片有限公司,生產(chǎn)批號:2013814。

AU 2700型全自動生化分析儀和B×41型光學(xué)顯微鏡 日本OLYMPUS公司;JEM-1200EX型透射電子顯微鏡 日本電子株式會社;WD-2102A型全自動酶標(biāo)儀 北京六一生物科技有限公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 桔梗多糖的制備 桔梗→粉碎→取50 g→蒸餾水1500 mL→浸泡12 h→超聲提取→濃縮→離心10 min→大于80%(w/v)醇沉→靜置12 h→離心→復(fù)溶→Sevag法除蛋白→D101大孔樹脂脫色→醇沉→桔梗多糖。

1.2.2納米硒桔梗多糖復(fù)合物的制備 于三頸瓶中加入120 mL的桔梗多糖水溶液(100 mg/L),置于40 ℃的水浴鍋中攪拌30 min 后,加入8.64 mg的固體Na2SeO3,繼續(xù)攪拌30 min,以1.5 mL/min的速度滴加 40 mL VC水溶液(3.75 mmol/L),使Na2SeO3與VC在反應(yīng)體系中的最終摩爾比為1∶3,繼續(xù)攪拌4 h,分別在410 nm和490 nm處測定吸光度,取A410/A490落在2.0～2.2的溶液,濃縮,冷凍干燥。

1.2.3 透射電鏡 用膠頭滴管滴加2滴納米硒桔梗多糖復(fù)合物溶液到透射電鏡專用銅網(wǎng)上,置于40 ℃烘箱內(nèi)干燥,放在透射電鏡上進(jìn)行觀察。

1.2.4 納米硒桔梗多糖復(fù)合物中硒含量的測定 精密稱取0.2 g的負(fù)載納米硒桔梗多糖復(fù)合物,按食品中硒含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.93-2017[19]熒光法測定硒含量。

1.2.5 急性毒性實驗 參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193.3-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性實驗》,采用霍恩氏法評價納米硒桔梗多糖復(fù)合物的急性毒性[20]。選用昆明種小鼠100只,雄性,隨機(jī)分為10組,每組10只,飼養(yǎng)一周后,禁食不禁水12 h。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,前5組分別一次性灌胃5、10、20、40和80 mg/kg·bw(按含硒計)的納米硒桔梗多糖復(fù)合物,第6到第10組組分別一次性灌胃給對應(yīng)劑量的Na2SeO3。連續(xù)觀察動物兩周,每天觀察一次,記錄動物體貌特征、活動狀況及死亡情況。

1.2.6 小鼠肝損傷模型的制備與給藥 取昆明種雄性小鼠70只,隨機(jī)分為7組,每組10只。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后,聯(lián)苯雙酯組灌胃按0.2 g/kg·bw劑量給藥,桔梗多糖組灌胃50 mg/kg·bw的桔梗多糖,納米硒桔梗多糖復(fù)合物高、中和低劑量組灌胃分別灌胃31.11、6.22、1.24 mg/kg·bw的納米硒桔梗多糖復(fù)合物,空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)灌胃給藥14 d;于第7 d和第14 d在給藥1 h后,除空白組外,各組小鼠均腹腔注射0.2%(體積分?jǐn)?shù))的CCl4橄欖油溶液(10 mL/kg·bw)。

1.2.7 肝損傷各項指標(biāo)的檢測 在末次給藥24 h后,摘眼球取血,室溫離心15 min(3000 r/min),用全自動生化儀測定血清中ALT、AST、ALP 活力,ALB和TP含量。選取小鼠肝臟的相同部位肝組織0.2 g用生理鹽水漂洗,制成10%的組織勻漿液,離心,取上清液,按試劑盒說明書測定GSH-PX活力、MDA和蛋白含量。

1.2.8 肝臟指數(shù)測定 在末次給藥24 h后,給小鼠稱重,處死,取肝臟洗凈后,吸干水分稱重,按公式:肝臟指數(shù)(%)=肝重/體重×100計算肝臟指數(shù)。

1.2.9 組織病理學(xué)觀察 取相同部位肝大葉用甲醛固定,按常規(guī)方法制備蠟塊,切片,HE染色,在光學(xué)顯微鏡下放大200倍進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)處理 用統(tǒng)計SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,多組計量資料分析采用SPSS中的單因素方差分析法(One-Way Anova),多重比較采用SPSS中的最小顯著性法(LSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1納米硒桔梗多糖復(fù)合物的形貌表征

如圖1所示,納米硒桔梗多糖復(fù)合物為球狀,且大小均一、分散較均勻。溶液放置2個月后仍呈透明紅色液體基本無沉降,X射線衍射顯示其固體為晶型粉末。

圖1 納米硒桔梗多糖粒子透射電鏡圖Fig.1 TEM picture of nanometer selenium particals

2.2納米硒桔梗多糖復(fù)合物的粒度與硒含量測定

經(jīng)透射電鏡測量,納米硒在桔梗多糖模板中的平均粒度約為50 nm,納米硒桔梗多糖復(fù)合物中含硒量平均為4.02%。

表2 小鼠血清中生化指標(biāo)的測定結(jié)果Table 2 Results of biochemical indexes in serum of mice

2.3納米硒桔梗多糖復(fù)合物的急毒實驗與分析

給藥1周后,灌胃給納米硒桔梗多糖復(fù)合物40和80 mg/kg·bw(按含硒計)劑量組的小鼠開始出現(xiàn)食欲不振,毛色變黃,體重下降現(xiàn)象,其中80 mg/kg·bw(按含硒計)劑量組的小鼠隨給藥天數(shù)的增加出現(xiàn)了尾部變紫,個別出現(xiàn)糞便顏色變紅的嚴(yán)重中毒癥狀;2周五組小鼠死亡統(tǒng)計依次分別為0、0、0、10%和30%,其LD50值無法求出;同劑量的Na2SeO3組小鼠除以上現(xiàn)象外,隨劑量增加還出現(xiàn)抽搐、輕微的呼吸困難等癥狀,死亡率依次為0、30%、60%、70%和100%,經(jīng)計算LD50為0.76 mg/kg·bw(以硒計)。以上結(jié)果表明納米硒桔梗多糖復(fù)合物的毒性小于Na2SeO3。

2.4納米硒桔梗多糖復(fù)合物對小鼠肝臟指數(shù)的影響

由表1可知,CCl4模型組與空白組小鼠比較肝臟指數(shù)顯著升高(p<0.01),這可能是由于CCl4造成了肝損傷引發(fā)了肝腫脹的結(jié)果。與模型組比,聯(lián)苯雙酯組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低(p<0.01),說明聯(lián)苯雙酯滴丸對CCl4導(dǎo)致的小鼠肝腫脹具有良好的抑制作用。桔梗多糖低劑量組與空白組比較肝臟指數(shù)顯著增大(p<0.05),說明桔梗多糖低劑量組對CCl4導(dǎo)致的小鼠肝腫脹有一定的干預(yù)作用,但作用較弱;不同濃度的納米硒桔梗多糖復(fù)合物組與模型組比較,中、高劑量組肝臟指數(shù)顯著降低(p<0.01),低劑量組的肝臟指數(shù)降低不顯著(p>0.05),說明了納米硒桔梗多糖復(fù)合物中的納米硒發(fā)揮了抑制肝損傷的作用,并隨著劑量的增大而作用增強(qiáng)?？傊?從以上肝臟指數(shù)測量的結(jié)果分析可知:納米硒桔梗多糖復(fù)合物對CCl4導(dǎo)致的小鼠肝腫脹均有一定的抑制作用,可推測納米硒桔梗多糖復(fù)合物對小鼠的肝臟具有一定的保護(hù)作用。

表1 小鼠肝重指數(shù)測定結(jié)果Table 1 The results of liver weight index of mice

注:與空白組相比,#p<0.05,##p<0.01;與模型組比較,*:p<0.05,**p<0.01;表2和表3同。

2.5納米硒桔梗多糖復(fù)合物對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

圖3 肝組織HE染色結(jié)果Fig.3 the results of HE staining of liver tissue

由表2可知,CCl4模型組與空白組比小鼠血清中ALT、AST和ALP水平顯著升高(p<0.01),而TP和ALB含量顯著降低(p<0.01),說明造模成功。聯(lián)苯雙酯組與空白組比小鼠血清生化指標(biāo)ALT、AST、ALP、TP和ALB均無顯著差異(p>0.05),表明聯(lián)苯雙酯滴丸可顯著改善CCl4引發(fā)的小鼠肝損傷。納米硒桔梗多糖復(fù)合物高、中、低劑量組和桔梗多糖組與模型組比小鼠血清中ALT、AST和ALP活力顯著降低(p<0.01,p<0.05),其降低的程度大小順序為:納米硒桔梗多糖復(fù)合物高劑量組>納米硒桔梗多糖復(fù)合物中劑量組>納米硒桔梗多糖復(fù)合物低劑量組>桔梗多糖;而TP和ALB含量顯著升高(p<0.01,p<0.05),各組升高的程度的大小為:納米硒桔梗多糖復(fù)合物高劑量組>納米硒桔梗多糖復(fù)合物中劑量組>納米硒桔梗多糖復(fù)合物低劑量組>桔梗多糖,結(jié)果表明:納米硒桔梗多糖復(fù)合物具有保護(hù)肝臟免受CCl4的影響。

2.6納米硒桔梗多糖復(fù)合物對肝組織中GSH-Px活力和MDA含量的影響

由表3可知,與空白組比較,模型組小鼠肝組織中GSH-Px活力和MDA含量均顯著升高(p<0.01),表明肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激。聯(lián)苯雙酯組與模型組比較GSH-Px活力和MDA含量顯著降低(p<0.01),與空白組比較GSH-Px活力和MDA含量均無顯著性差異。納米硒桔梗多糖復(fù)合物的高、中劑量組與模型組小鼠比較,肝組織中GSH-Px活力和MDA含量均顯著降低(p<0.05,p<0.01),而桔梗多糖治療組、納米硒桔梗多糖復(fù)合物低劑量治療組與模型組相比GSH-Px活力和MDA含量都有不同程度的降低(p<0.05),與空白組比GSH-Px活力和MDA含量有不同程度的升高(p<0.01),這表明桔梗多糖和納米硒桔梗多糖復(fù)合物對CCl4所導(dǎo)致的小鼠肝損傷均起到了一定保護(hù)作用;其保護(hù)作用的大小為:納米硒桔梗多糖復(fù)合物高劑量組>納米硒桔梗多糖復(fù)合物中劑量組>納米硒桔梗多糖復(fù)合物低劑量組>桔梗多糖,且納米硒桔梗多糖復(fù)合物高劑量組的治療效果與陽性藥物聯(lián)苯雙酯的治療效果相近保護(hù)作用最好。納米硒桔梗多糖復(fù)合物對肝臟的保護(hù)作用可能源于對硒的吸收,因為納米硒的納米微粒表面的原子數(shù)及懸鍵和不飽和鍵更多,使其具有高的表面活性[21],更易于被吸收。由于硒的吸收在體內(nèi)可形成谷胱苷肽過氧化酶,它能夠分解血液中的脂質(zhì)過氧化物,可引起機(jī)體的過氧化物酶活力降低。

表3 小鼠肝組織中MDA 的含量和GSH-Px 的活力Table 3 Contents of MDA and Activity of GSH-Px in liver tissue

2.7組織病理學(xué)結(jié)果

由圖3可知,空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索排列規(guī)則,沒有病變、壞死的肝組織;模型組肝細(xì)胞形態(tài)模糊,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞核出現(xiàn)許多空泡,大小不一,細(xì)胞壞死,水腫現(xiàn)象嚴(yán)重;聯(lián)苯雙酯組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰,肝細(xì)胞炎性反應(yīng)明顯降低;桔梗多糖組、納米硒桔梗多糖復(fù)合物低劑量組細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂,部分細(xì)胞核有空泡,但相對于模型組有一定的改善;納米硒桔梗多糖復(fù)合物中劑量組和高劑量組小鼠肝細(xì)胞排列整齊,沒有細(xì)胞水腫,表明肝細(xì)胞沒有受到損傷,說明納米硒桔梗多糖復(fù)合物明顯地保護(hù)了肝組織。

3 結(jié)論

本實驗證實桔梗多糖和不同劑量的納米硒桔梗多糖復(fù)合物對CCl4造成的小鼠肝損傷有不同程度的保護(hù)作用,其保肝效果:納米硒桔梗多糖復(fù)合物高劑量組>中劑量組>低劑量組>桔梗多糖。且中、高劑量的納米硒桔梗多糖復(fù)合物對肝損傷治療效果最好,與聯(lián)苯雙酯滴丸的療效相近。因此,本實驗找到了一個較好的制備納米硒的新模板——桔梗多糖,從而提高了桔梗植物的利用價值。實驗也證明了納米硒桔梗多糖復(fù)合物的保肝作用強(qiáng)于桔梗多糖本身。本文為開發(fā)新型的含硒保肝藥物提供了一定的科學(xué)依據(jù),也為其它活性的進(jìn)一步研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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