,,2,*

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723001)

我國(guó)的季節(jié)性水果很多,如桑椹、草莓等漿果,柔軟多汁,表皮極薄,在采摘和運(yùn)輸過(guò)程中極易受到損害,不耐貯運(yùn)和貯藏,貨架期極短。桑椹在常溫條件下僅能保鮮12～18 h[1],草莓在常溫下放置1～2 d就會(huì)出現(xiàn)變色、變味、軟化腐爛[2],大大降低其商品性,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失;還有極易氧化的水果,如蘋(píng)果,它的果肉裸露在空氣中2～3 min就會(huì)發(fā)生褐變。因此,桑椹、草莓等漿果的貯藏保鮮和蘋(píng)果的延緩氧化一直以來(lái)都是科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。所以,為了延長(zhǎng)水果的食用和加工供貨期,研究其保鮮技術(shù)顯得尤為重要。

精胺(SPM)是多胺的一種,帶有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的脂肪族化合物,具有一定的生物活性,少量精胺是生物體內(nèi)正常存在的成分,在生物細(xì)胞中具有重要的生理功能。精胺在生物體中廣泛存在,朱新衛(wèi)[3]等研究指出,精胺能延緩賽買(mǎi)提杏的果實(shí)硬度和可溶性固形物含量的下降,降低腐爛率,有效提高其貯藏品質(zhì)。張政[4]等研究也指出,精胺能夠顯著延緩鮮棗果實(shí)的衰老,提高果實(shí)冷藏期間的貯藏品質(zhì)。劉春泉[5]等以蔬菜大豆為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了外源精胺對(duì)其冷害、采后保鮮的機(jī)制,結(jié)果顯示精胺能有效延緩蔬菜大豆的貯藏冷害。由此可見(jiàn),果蔬中精胺的含量對(duì)其貯后品質(zhì)具有重要的研究意義。因此,發(fā)展一種更為簡(jiǎn)便、快速、靈敏且適于痕量檢測(cè)的方法十分必要。

目前,多胺的分析方法主要是高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、超高效液相色譜法UPLC[8-10],國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[11]的衍生過(guò)程耗時(shí),檢出限偏高,操作繁雜。此外,還有電化學(xué)傳感技術(shù)[12]、毛細(xì)管電色譜-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法[13],這兩種技術(shù)都具備檢測(cè)范圍寬、檢出限低、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),但實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣。毛細(xì)管電泳是繼傳統(tǒng)電泳和色譜方法發(fā)展而來(lái)的一種分離技術(shù),具有分離速率高、分析時(shí)間短、樣品消耗痕量等優(yōu)點(diǎn)。含氮基團(tuán)能夠與釕聯(lián)吡啶發(fā)生化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生光信號(hào),且釕聯(lián)吡啶電化學(xué)發(fā)光技術(shù)靈敏度高、分析控制性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、成本低。基于此,本文通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管電泳和檢測(cè)條件,建立了精胺的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光技術(shù)分析方法,并將該方法應(yīng)用于草莓、桑椹、蘋(píng)果等水果中精胺的檢測(cè)。文中首次將CE-ECL檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于水果中精胺的分析,對(duì)研究水果采后保鮮貯藏和延長(zhǎng)貨架期,具有重大的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

桑椹、草莓、蘋(píng)果(一等級(jí)鮮果質(zhì)量要求,食用成熟度)[14-16]陜西理工大學(xué)北門(mén)水果市場(chǎng);釕聯(lián)吡啶 Ru(bpy)3Cl2·6H2O,99.95%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;精胺標(biāo)準(zhǔn)品98% 百靈威科技有限公司;其他試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 二級(jí)蒸餾水。

MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(該檢測(cè)儀器主要包括數(shù)控毛細(xì)管電泳高壓電源、電化學(xué)分析儀、多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀和多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器) 西安瑞邁分析儀器有限公司生產(chǎn),中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所研發(fā);KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-20M離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Millipore超純水機(jī) 美國(guó),Millipore公司;AL 204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；未涂層的熔融石英毛細(xì)管(50 cm×25 μm i.d.),CE及ECL檢測(cè)采用三電極系統(tǒng):工作電極是直徑500 μm的鉑絲電極,參比電極是直徑300 μm的Ag/AgCl電極(飽和KCl溶液),輔助電極為直徑1 mm的鉑電極 西安瑞邁分析儀器有限公司;0.22 μm的尼龍纖維素膜 津隆。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取0.010 g精胺,然后加水稀釋到10 mL,搖勻,用0.22 μm濾膜過(guò)濾,置于4 ℃冰箱中密封冷藏備用。

1.2.2 樣品前處理 取足量桑椹、草莓、蘋(píng)果等樣品,分別將其在預(yù)冷研缽中搗碎,準(zhǔn)確稱取三種樣品各1.000 g加入到50 mL離心管中,加入10 mL 0.1 mol/L HCl,攪拌提取25 min,4 ℃ 4000 r/min離心10 min,取上清液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾,置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3 毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)步驟 選取內(nèi)徑為25 μm×50 cm未涂層溶融石英毛細(xì)管。實(shí)驗(yàn)前對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行處理。首次使用毛細(xì)管前先用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h進(jìn)行活化,每天實(shí)驗(yàn)前需依次用0.1 mol/L NaOH、超純水壓力沖洗10 min,再用分離緩沖液平衡10 min以上。

工作電極為鉑絲電極,長(zhǎng)期使用2～3個(gè)月,當(dāng)鉑絲電極發(fā)黑以后,需用金相砂紙打磨后再用粒徑0.05金相的氧化鋁粉末在絨布上拋光平整,達(dá)到鏡面效果,再使用超純水超聲清洗8 min,晾干后使用。參比電極為Ag/AgCl電極,當(dāng)發(fā)現(xiàn)有沉淀時(shí),需要及時(shí)更換。利用光學(xué)顯微鏡觀察,使工作電極與毛細(xì)管出口對(duì)齊,并調(diào)整兩者之間的距離為100 μm。

1.2.4 檢測(cè)條件及毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化

1.2.4.1 檢測(cè)電位的優(yōu)化 在1.2.3的基礎(chǔ)上,考察檢測(cè)電位在1.00～1.30 V范圍內(nèi),ECL強(qiáng)度的變化趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)條件為5 mmol/L的釕聯(lián)吡啶(溶于pH7.8硼酸鹽緩沖液),運(yùn)行緩沖液為12 mmol/L的硼酸鹽緩沖液(pH7.8),固定其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值,以精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)檢測(cè)電位進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4.2 檢測(cè)池中緩沖液濃度和pH的優(yōu)化 在1.2.3的基礎(chǔ)上,結(jié)合優(yōu)化的檢測(cè)電位,其他參數(shù)不變的條件下,研究25～150 mmol/L硼酸鹽緩沖液濃度對(duì)ECL強(qiáng)度的變化影響。固定檢測(cè)池緩沖液的濃度為50 mmol/L,在pH7.4～8.7范圍內(nèi)考察硼酸鹽緩沖液pH對(duì)ECL強(qiáng)度的影響。

1.2.4.3 運(yùn)行緩沖液濃度和pH的優(yōu)化 在1.2.3的基礎(chǔ)上,結(jié)合優(yōu)化的檢測(cè)電位、檢測(cè)池中緩沖液濃度和pH,控制硼酸鹽緩沖液的pH為7.8,在濃度為4～24 mmol/L范圍內(nèi)研究其對(duì)ECL強(qiáng)度的影響;同時(shí)固定運(yùn)行緩沖液的濃度為12 mmol/L,觀察pH在7.4～9.0范圍內(nèi)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化。

1.2.4.4 運(yùn)行高壓、進(jìn)樣高壓、進(jìn)樣時(shí)間的優(yōu)化 在已優(yōu)化的檢測(cè)條件下,研究運(yùn)行高壓在9～19 kV內(nèi)對(duì)樣品遷移時(shí)間和分離的影響;進(jìn)樣高壓在6～18 kV范圍內(nèi)、進(jìn)樣時(shí)間在2～16 s范圍對(duì)ECL強(qiáng)度及理論塔板數(shù)的影響。理論塔板數(shù)通過(guò)半峰寬和遷移時(shí)間來(lái)進(jìn)行計(jì)算,公式為:N=5.54(tm/Y1/2)2,其中N是待測(cè)樣品的理論塔板數(shù);tm是待測(cè)樣品的遷移時(shí)間;Y1/2是待測(cè)樣品的半峰寬。

1.2.5 線性關(guān)系 將1 mg/mL精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為0.1、0.01、0.05、0.001 mg/mL,按照1.2.4中優(yōu)化的檢測(cè)條件和毛細(xì)管電泳條件進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè),記錄其對(duì)應(yīng)的ECL強(qiáng)度。以不同濃度精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)、ECL強(qiáng)度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線用I=pc+q表示。

1.2.6 檢出限 在信噪比約為3時(shí)計(jì)算檢出限。

1.2.7 精密度 對(duì)0.14 mmol/L的精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣7次,按照1.2.4中的優(yōu)化條件進(jìn)樣,計(jì)算其遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.8 樣品測(cè)定 按照1.2.2中的方法制備樣品,按照1.2.4中的優(yōu)化條件進(jìn)樣,分別測(cè)定桑椹、草莓、蘋(píng)果3種樣品。

1.2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 分別取待測(cè)樣適量,平均分成3份,將0.03、0.06、0.14 mmol/L三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密加入到待測(cè)樣品中(平行三份),按1.2.4中檢測(cè)條件進(jìn)行分析,計(jì)算回收率和RSD。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)計(jì)算均在Microsoft Excel 2010中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)條件及毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)電位的優(yōu)化 檢測(cè)電位是影響發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的一個(gè)決定性因素之一。實(shí)驗(yàn)中采用恒電位法研究檢測(cè)電位對(duì)精胺電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響。結(jié)果如圖1所示,在1.00～1.10 V之間,ECL強(qiáng)度隨著檢測(cè)電位的增大而呈直線上升,在1.10～1.20 V之間,光強(qiáng)度的增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩,但是出現(xiàn)基線上揚(yáng),信噪比差,之后,繼續(xù)增加檢測(cè)電位,光強(qiáng)反而減小。因此,結(jié)合ECL強(qiáng)度和檢測(cè)基線,以1.15 V作為本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)檢測(cè)電位。

圖1 檢測(cè)電位對(duì)ECL強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of detection potential on the ECL intensity

2.1.2 檢測(cè)池中緩沖液濃度和pH的優(yōu)化 檢測(cè)池中溶解釕聯(lián)吡啶的硼酸鹽緩沖液濃度和pH對(duì)ECL強(qiáng)度有一定的影響。如圖2(a)所示,在50 mmol/L硼酸鹽緩沖液下,精胺有滿意的發(fā)光強(qiáng)度和信噪比。

圖2 檢測(cè)池中濃度(a)和pH(b)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH(b)and concentration(a)in detection cell on ECL intensity

2.1.3 運(yùn)行緩沖液濃度和pH的優(yōu)化 運(yùn)行緩沖液的濃度能通過(guò)影響毛細(xì)管壁對(duì)樣品的吸附能力而影響分離效果,運(yùn)行緩沖液的pH能通過(guò)影響毛細(xì)管內(nèi)部的電滲流而影響樣品的遷移時(shí)間。如圖3(a),當(dāng)緩沖液的濃度為12 mmol/L時(shí),ECL強(qiáng)度達(dá)到最大。而當(dāng)運(yùn)行緩沖液的 pH在7.8 時(shí)ECL強(qiáng)度明顯較高(如圖3(b))。故選擇pH7.8,濃度為12 mmol/L的硼酸鹽緩沖液。

圖3 運(yùn)行緩沖液濃度(a)和pH(b)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of running buffer pH(b)and running concentration(a)on the intensity of ECL

2.1.4 運(yùn)行高壓、進(jìn)樣高壓、進(jìn)樣時(shí)間的優(yōu)化 運(yùn)行高壓主要影響樣品的遷移時(shí)間和分離效率。在運(yùn)行高壓9～19 kV范圍內(nèi)變化時(shí),遷移時(shí)間從370.8 s降到185.6 s,變化范圍很大。本實(shí)驗(yàn)研究了運(yùn)行高壓對(duì)樣品遷移時(shí)間和分離的影響,結(jié)果如圖4所示,在9～15 kV范圍內(nèi),ECL強(qiáng)度隨著運(yùn)行高壓的升高呈直線遞增,當(dāng)運(yùn)行高壓為17 kV時(shí),發(fā)光強(qiáng)度明顯下降,這是由于運(yùn)行高壓過(guò)大,毛細(xì)管產(chǎn)生焦耳熱,樣品在極短的時(shí)間內(nèi)由毛細(xì)管進(jìn)入檢測(cè)池,使得各電極表面釕聯(lián)吡啶濃度稀釋,發(fā)光效率降低。故綜合考慮遷移時(shí)間、分離效率、靈敏度、噪音和焦耳熱等因素,確定最佳運(yùn)行高壓為15 kV。

進(jìn)樣高壓和進(jìn)樣時(shí)間決定著樣品進(jìn)樣量的大小,進(jìn)而影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和分離效率。精胺的分離效率通過(guò)理論塔板數(shù)得來(lái)。精胺進(jìn)樣方式采用的是電動(dòng)進(jìn)樣,在已優(yōu)化的檢測(cè)條件下,如圖5(A)所示,隨著進(jìn)樣高壓的遞增,ECL強(qiáng)度也呈上升趨勢(shì),而理論塔板數(shù)則一直下降,同時(shí)在運(yùn)行高壓為14 kV時(shí)出現(xiàn)峰展寬嚴(yán)重,柱效降低,且在18 kV出現(xiàn)嚴(yán)重的基線上揚(yáng)。所以選擇14 kV作為最佳進(jìn)樣高壓。圖5(B)中隨著進(jìn)樣時(shí)間的增大,ECL強(qiáng)度增大,理論塔板數(shù)減小,遷移時(shí)間延后,精胺的峰形變寬。所以,選擇最佳進(jìn)樣時(shí)間為8 s。

圖4 運(yùn)行高壓對(duì)ECL強(qiáng)度(a)和遷移時(shí)間(b)的影響Fig.4 Effect of running voltage on the intensity and migration time of ECL

圖5 進(jìn)樣高壓(A)和進(jìn)樣時(shí)間(B)對(duì)ECL強(qiáng)度(a)及理論塔板數(shù)(b)的影響Fig.5 Effect of injection voltage(A)and injection time(B) on the intensity(a)and plate number(b)of ECL

2.2線性范圍、檢出限、精密度

精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在2×10-4～3×10-1mmol/L濃度范圍內(nèi)與ECL強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,其線性方程為I=1114.2c+99.41(r=0.9996),檢出限(S/N=3)為9.9×10-5mmol/L。

對(duì)0.14 mmol/L的精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行7次檢測(cè),得到其遷移時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.7%、3.5%、2.7%,表明該儀器的精密度良好[18]。

2.3樣品測(cè)定和加標(biāo)回收率

如圖6所示為未加標(biāo)待測(cè)樣品與加標(biāo)后樣品的毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光對(duì)照?qǐng)D,可發(fā)現(xiàn)加標(biāo)后的ECL強(qiáng)度明顯高于未加標(biāo)的待測(cè)樣。表1為3種樣品中精胺含量及其加標(biāo)回收率。

圖6 樣品待測(cè)液未加標(biāo)(A、C、E)與加標(biāo)0.14 mmol/L(B、D、F)的CE-ECL圖Fig.6 Electropherograms of aquatic product samples(A、C、E) and added 0.14 mmol/L standard samples(B、D、F)

表1 3種樣品中精胺含量及其加標(biāo)回收率Table 1 Spermine content and the recovery adding standard in three kinds of samples

3 結(jié)論

本文建立了一種用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光分離檢測(cè)水果中精胺含量的新方法,并對(duì)影響分離檢測(cè)精胺的各影響因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下,該方法的最低檢出限(S/N=3)可達(dá)9.9×10-5mmol/L,線性范圍2×10-4～3×10-1mmol/L,線性相關(guān)系數(shù)r=0.9996,在6 min內(nèi)即可完成分離檢測(cè)。該方法用于檢測(cè)精胺具有操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)快速,靈敏度高,樣品消耗少,以及重現(xiàn)性良好和成本低等優(yōu)勢(shì),為其他多胺的檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),且對(duì)今后研究果蔬采后保鮮貯藏和延長(zhǎng)貨架期提供了理論依據(jù)。

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