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(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541004;2.廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西桂林 541004)

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染所導(dǎo)致的肝臟疾病,隨著疾病的進(jìn)展,最終演變?yōu)楦喂δ墚惓?、肝硬化或甚至肝癌。全球乙肝病毒攜帶者有3.5～4億人,中國(guó)為乙型肝炎高流行區(qū),HBV攜帶者約有1.3億,慢性肝炎患者約3000萬人[1]。用以拉米夫啶、恩替卡韋等為代表的核苷類藥物抗乙肝病毒治療是目前臨床上公認(rèn)的治療方案,但是長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致耐藥病毒株日益增多,HBV病毒學(xué)反彈,藥物治療不良反應(yīng)多等現(xiàn)象[2]。肝臟的主要功能是代謝,但同時(shí)它也有著去氧化的作用。國(guó)內(nèi)外研究表明肝臟負(fù)荷過大,去氧化能力下降導(dǎo)致肝臟被自由基損傷也與肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展有著很大的關(guān)系[3]。因而,尋求新的治療方案和開發(fā)更安全有效的藥物對(duì)患者進(jìn)行抗炎保肝、抗病毒、清除自由基和免疫調(diào)節(jié)綜合治療是一種趨勢(shì)。

黑枸杞(LyciumruthenicumMurr)藏藥稱“旁瑪”,為茄科枸杞屬灌木植物,具棘刺,分布于我國(guó)西北地區(qū)[4]。研究發(fā)現(xiàn),黑枸杞有抗血脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、預(yù)防及治療心血管疾病的應(yīng)用價(jià)值[5]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用大孔吸附樹脂對(duì)黑枸杞分離提純,得到黑枸杞提取物[6],其提取物具有降低肝臟中脂肪含量及保肝[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化活性[9]等多種藥理學(xué)效應(yīng)。

研究顯示很多植物藥具有良好的抗乙肝功效,例如鹽酸千金藤堿[10]、綠茶兒茶素[11]、甘草提取液[12]、天花粉水提物[13]等多種天然藥物均有抗HBV作用,但黑枸杞提取物是否有抗乙肝作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究黑枸杞提取物對(duì)體外HepG22.2.15細(xì)胞模型分泌HBsAg和HbeAg的影響,從細(xì)胞水平上觀測(cè)和評(píng)價(jià)其抗HBV作用。并通過檢測(cè)黑枸杞提取物的·OH 的清除率、DPPH· 的清除率、還原能力來測(cè)定其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黑枸杞干果 購買于甘肅;DMEM高糖培養(yǎng)基、G418 美國(guó)Gibco公司;胎牛血清 奧地利PAA公司;谷氨酰胺 美國(guó)Sigma公司;HBsAg、HBeAg試劑盒 中國(guó)上?？迫A生物工程股份有限公司;MTT試劑盒 美國(guó)Amresco公司;HepG22.2.15細(xì)胞系 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病毒研究所;拉米夫定 英國(guó)葛蘭素史克制藥有限公司;硫酸亞鐵、鐵氰化鉀 分析純,中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鐵、過氧化氫 分析純,中國(guó)西隴科學(xué)股份有限公司;抗壞血酸 中國(guó)山東佰仟化工有限公司;DPPH標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司;XSBIA倒置顯微鏡 中國(guó)上海蔡康光學(xué)儀器有限公司;超凈工作臺(tái) 中國(guó)天津塵埃凈化設(shè)備廠;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)BioTek公司;MVExc47/11-6液氮存貯灌 美國(guó)MVE公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑枸杞提取物的制備 稱取經(jīng)干燥粉碎的黑枸杞粉末20 g,并按照固液比1∶10用55 ℃超純水浸提,過D101大孔樹脂,70%乙醇洗脫,-0.1 MPa下減壓回收乙醇并冷凍干燥得到黑色結(jié)晶粉末[14]。

1.2.2 黑枸杞提取物體外抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物分組 培養(yǎng)基制備:DMEM 中加入380 mg·L-1G418,15%胎牛血清,2 mmol·L-1谷氨酰胺,1%青、鏈霉素,5%碳酸氫鈉并且調(diào)節(jié)pH7.2～7.4。HepG22.2.15細(xì)胞以1×104mL接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后加藥。黑枸杞提取物用培養(yǎng)基溶解,無菌過濾,稀釋為不同質(zhì)量濃度:100、50、25、12.5 mg/L,分組加入96孔板中,在同等條件下,設(shè)無血清培養(yǎng)基并且不加黑枸杞提取物組為陰性對(duì)照組,拉米夫定組(終質(zhì)量濃度100、50、25、12.5 mg/L)為陽性對(duì)照。加藥后每3 d收集上清液一次,再加入新的含藥培養(yǎng)基,共孵育9 d。收集的第3、6、9 d上清液于-20 ℃冰箱保存待測(cè)[15]。

1.2.2.2 黑枸杞提取物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法) 體外培養(yǎng)HepG22.2.15細(xì)胞用于檢測(cè)黑枸杞提取物的細(xì)胞毒作用。細(xì)胞接種于96孔板,每孔190 μL,加入藥物處理9 d。第9 d收集上清液后加入新的培養(yǎng)基190 μL,每孔加入20 μL MTT,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱再培養(yǎng)4 h。棄掉上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解孔內(nèi)生成的MTT-甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值,對(duì)各孔細(xì)胞生成的甲瓚進(jìn)行定量。與對(duì)照組(細(xì)胞存活率100%)進(jìn)行比較,計(jì)算出各孔細(xì)胞存活率,以判斷藥物的細(xì)胞毒性作用。

細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100[16]

1.2.2.3 檢測(cè)黑枸杞提取物對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響 根據(jù)雙抗體夾心ELISA試劑盒說明測(cè)定 HepG22.2.15細(xì)胞上清液HBsAg和HBeAg的表達(dá)。計(jì)算藥物對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的抑制率。

抑制率(%)=(N-P)/(N-空白)×100

式中,N為陰性對(duì)照孔A值;P為實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔HbsAg或HbeAg的A值;空白為空白孔A值。

1.2.3 黑枸杞提取物的抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 不同濃度提取物對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力測(cè)定 通過Fenten反應(yīng)產(chǎn)生· OH,在試管中依次加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液100 μL,9 mmol/L的FeSO4100 μL,黑枸杞提取物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL溶液不同濃度提取物100 μL,8.8 mmol/L H2O21 mL啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)。37 ℃水浴加熱15 min,然后離心機(jī)4000 r/min離心3 min。最后在510 nm下測(cè)定吸光度并設(shè)為A1。用100 μL蒸餾水代替FeSO4重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到A2,用100 μL去離子水代替提取物重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到A3。用抗壞血酸作為陽性對(duì)照,最后按下式計(jì)算羥基自由基的清除率:

·OH的清除率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100

DPPH·的清除率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100

1.2.3.3 不同濃度提取物還原能力的測(cè)定 黑枸杞提取物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液。將250 μL pH6.6磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)和250 μL 1%的鐵氰化鉀溶液混合,取待測(cè)提取物溶液50 μL加到混合液中,在50 ℃條件下保溫20 min,加入250 μL 10%的三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,最后取上清液250 μL,與250 μL 2.5 mL蒸餾水和100 μL 0.1%的氯化鐵混合,10 min后在700 nm下測(cè)定吸光值,用抗壞血酸作為陽性對(duì)照,吸光度值與還原能力呈正比例關(guān)系。

表2 黑枸杞提取物對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的影響Table 2 Effects of black wolfberry extracts on HBsAg expression in HepG2 2.2.15 cells(±s,n=3)

注:與陰性對(duì)照組比較,*p<0.05;表3同。

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1黑枸杞提取物對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞毒性作用

用MTT法檢測(cè)黑枸杞提取物對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞增殖的影響。黑枸杞提取物孵育細(xì)胞9 d后,結(jié)果顯示黑枸杞提取物對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞無細(xì)胞毒作用,各濃度細(xì)胞存活率均>100%,隨著濃度的增加細(xì)胞呈增生趨勢(shì)。而陽性對(duì)照組拉米夫啶在50～100 mg/L對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞有一定毒性作用。提示黑枸杞提取物可促進(jìn)HepG22.2.15細(xì)胞的增長(zhǎng),結(jié)果見表1。

表1 黑枸杞提取物對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞的毒性作用(n=3)Table 1 Cytotoxic effects of black wolfberry extracts on HepG22.2.15 cells(n=3)

2.2黑枸杞提取物對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)影響

黑枸杞提取物作用于細(xì)胞后,可抑制HepG22.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌。黑枸杞提取物高濃度和中濃度對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的抑制率呈遞增趨勢(shì)。高質(zhì)量濃度100 mg/L第3、6、9 d對(duì)HBsAg的抑制率分別是8.20%、38.78%、53.22%。質(zhì)量濃度50 mg/L第3、6、9 d對(duì)HBsAg的抑制率分別是-16.80%、-5.2%、11.53%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析說明,黑枸杞提取物在第9 d最高質(zhì)量濃度100 mg/L對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBsAg有抑制作用,其在質(zhì)量濃度50 mg/L時(shí)對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBsAg的表達(dá)抑制作用弱,前中期第3、6 d對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞HBsAg的表達(dá)可能還有促進(jìn)作用。陽性對(duì)照組拉米夫定對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用弱,最高質(zhì)量濃度100 mg/L第9 d對(duì)HBsAg和HBeAg抑制率為17.37%、27.10%,這與本實(shí)驗(yàn)室以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[18]及李桂秋、劉江霞報(bào)道的結(jié)果一致[19-20]。結(jié)果見表2。

黑枸杞提取物高質(zhì)量濃度和中質(zhì)量濃度對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的抑制率也呈遞增趨勢(shì)。最高質(zhì)量濃度100 mg/L第3、6、9 d對(duì)HBeAg的抑制率分別是41.67%、60.45%、72.83%。在質(zhì)量濃度50 mg/L第3、6、9 d對(duì)HBeAg的抑制率分別是13.34%、14.62%、47.31%,見表3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析說明黑枸杞提取物在第6、9 d最高質(zhì)量濃度100 mg/L對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg的表達(dá)有明顯抑制作用,而在質(zhì)量濃度50 mg/L時(shí)對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg的表達(dá)抑制作用弱,在質(zhì)量濃度25 mg/L時(shí),前中期第3、6 d對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞HBeAg的表達(dá)可能還有促進(jìn)作用。結(jié)果見表3。

2.3黑枸杞提取物的抗氧化活性

2.3.1 不同濃度提取物對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力 由圖1可知,黑枸杞提取物濃度與抗壞血酸清除率呈正相關(guān)的關(guān)系。在相同濃度下,抗壞血酸對(duì)·OH的清除率要高于黑枸杞提取物對(duì)·OH 的清除率?？箟难酙C50值為1.501 mg/mL,黑枸杞提取物IC50值為26.559 mg/mL。圖1中黑枸杞提取物濃度為5.0 mg/mL時(shí)清除率最高,為21.07%。由此可知黑枸杞提取物有羥自由基清除能力,但在同等濃度條件下要低于陽性對(duì)照抗壞血酸。

表3 黑枸杞提取物對(duì)HepG22.2.15 細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響Table 3 Effects of black wolfberry extracts on HBeAg expression in HepG2 2.2.15 cells(±s,n=3)

圖1 黑枸杞提取物對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力Fig.1 Scavenging effects on hydroxyl radical (·OH)of black wolfberry extracts

2.3.2 不同濃度提取物對(duì)DPPH自由基(DPPH·)清除能力 由圖2可知,黑枸杞提取物濃度的DPPH·的清除率較高。當(dāng)黑枸杞提取物在0.05～0.15 mg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí),其對(duì)DPPH·的清除能力明顯高于陽性對(duì)照抗壞血酸?？箟难酙C50值為0.276 mg/mL,圖中黑枸杞提取物濃度為0.30 mg/mL清除率最高,為97.25%。所以,黑枸杞提取物具有良好的清除DPPH·能力。

圖2 黑枸杞提取物對(duì)DPPH自由基(DPPH·)清除能力Fig.2 Scavenging effects on DPPH free radical(DPPH·)of black wolfberry extracts

2.3.3 不同濃度提取物的還原能力 由圖3可知,黑枸杞提取物的還原能力隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。但是在相同濃度下,抗壞血酸的還原能力要高于黑枸杞提取物對(duì)的還原能力。圖中黑枸杞提取物濃度為3.0 mg/mL時(shí)清除率最高,為1.440。因此黑枸杞提取物有還原能力,但同等濃度條件下要低于陽性對(duì)照抗壞血酸。

圖3 黑枸杞提取物的還原能力Fig.3 Reducing power of black wolfberry extracts

3 結(jié)論

在研究中發(fā)現(xiàn),黑枸杞提取物在體外對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞沒有毒性作用,可抑制HepG22.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg的表達(dá),具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。同時(shí),黑枸杞提取物有清除·OH和DPPH·的能力和還原能力,隨著提取物濃度的增加其清除能力與還原能力逐漸增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與閆亞美等證實(shí)黑枸杞提取物抗氧作用基本一致[21]?；ㄇ嗨厥呛阼坭降挠行С煞趾统噬奈镔|(zhì)[22],所以黑枸杞是天然的自由基清除劑,其抗氧化活性與花青素有關(guān),對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用,其提取物抗病毒的有效成分和原理值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中所用的陽性藥物拉米夫定主要是通過抑制HBV DNA的表達(dá)[12]發(fā)揮治療乙肝的作用,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示其對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的分泌抑制作用不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kruining等[23]和WillIan等[24]報(bào)道拉米夫HepG22.2.15細(xì)胞中基本不影響HBsAg和HBeAg的分泌相同。在低濃度(12.5、25 mg/L)的時(shí)候,反而似乎有促進(jìn)抗原表達(dá)的現(xiàn)象,但這現(xiàn)象隨著用藥時(shí)間的沿長(zhǎng),呈降低趨勢(shì),在任衍菊等[25]的報(bào)道中也有類似現(xiàn)象?？紤]是藥物濃度相對(duì)低并且作用間短的情況下,受到細(xì)胞種板密度和細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快等因素影響造成。

綜上所述,黑枸杞提取物能抑制乙肝病毒,并且有著良好的抗氧化保肝作用,可在后續(xù)研究中進(jìn)一步分離提取找到活性單體成分,探討其體內(nèi)外抗HBV機(jī)制,為抗乙肝藥物研發(fā)提供參考。

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