鄭國(guó)建，李 珊

（雅培貿(mào)易（上海）有限公司，上海200233）

營(yíng)養(yǎng)品中含有人體欠缺及損失的營(yíng)養(yǎng)成分，這些成分是保持身體健康的必要物質(zhì)。隨著人們生活水平的提高，健康意識(shí)越來(lái)越強(qiáng)，我國(guó)營(yíng)養(yǎng)品市場(chǎng)存在較大發(fā)展空間。

蟲草素的化學(xué)名稱為3′－脫氧腺苷，是冬蟲夏草和蛹蟲草的主要活性成分之一［1］。有研究表明蟲草素可改善缺血小鼠的學(xué)習(xí)能力，促進(jìn)海馬神經(jīng)元的修復(fù)［2］，可抑制肺癌細(xì)胞株的增值和遷移過(guò)程［3］，具有消炎［4］、抗腫瘤［5］、調(diào)節(jié)人體免疫功能等顯著作用?；谙x草素的上述功能，將蟲草素添加到營(yíng)養(yǎng)品中可極大地提高產(chǎn)品附加值，可調(diào)節(jié)人體的生理機(jī)能，為消費(fèi)者提供營(yíng)養(yǎng)支持。

目前測(cè)定蟲草素的方法主要用于測(cè)定冬蟲夏草、蛹蟲草及其發(fā)酵液中的蟲草素含量［6－9］，但是沒(méi)有用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)品中蟲草素的方法。營(yíng)養(yǎng)品基質(zhì)復(fù)雜，含有淀粉、麥芽糊精、多種營(yíng)養(yǎng)素和礦物質(zhì)，容易對(duì)測(cè)定結(jié)果造成干擾。本工作采用高效液相色譜法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)品中蟲草素的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配二元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、進(jìn)樣器溫控、柱溫箱、多波長(zhǎng)檢測(cè)器（MWD）；Milli－Q型純水系統(tǒng)。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：200.0mg·L－1，稱取標(biāo)準(zhǔn)品20.00mg于100mL容量瓶中，用水溶解并定容，在－20℃冰箱中保存，備用。

偏磷酸溶液：30.0g·L－1，稱取偏磷酸30.00g于裝有約600mL水的1L燒杯中，在磁力攪拌器上溶解，轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用水定容。

偏磷酸為分析純，乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為純水。

1.2 色譜條件

Phenomenex Gemini C18色 譜 柱 （250mm×4.6mm，5μm）；柱溫35℃；流量1.0mL·min－1；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～16.0min時(shí)，A 為95%；16.0～16.1min時(shí)，A由95%線性降至10%；16.1～23.0min時(shí)，A為10%；23.0～23.1min時(shí)，A 由10%線性升至95%；23.1～30.0min時(shí)，A 為95%。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取營(yíng)養(yǎng)品樣品10.00g，加水至50.00g，加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌10min，使其充分溶解。從稀釋好的樣品里稱取2.50g溶液至50mL容量瓶中，加水30mL，混勻，超聲10min，加入30.0g·L－1偏磷酸溶液1.0mL，輕輕振蕩，加水稀釋至刻度，樣品經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的選擇

試驗(yàn)使用速溶蟲草素作為營(yíng)養(yǎng)品的原料，采用干法工藝的方式進(jìn)行添加，所以在樣品處理過(guò)程中要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)溶，以盡可能減少由于樣品不均勻造成的測(cè)定值波動(dòng)。

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY／T 2116－2012［10］中使用水直接提取樣品中的蟲草素。但是在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)如果只加水溶解提取營(yíng)養(yǎng)品中的蟲草素，得不到澄清的液體，不利于后續(xù)的液相色譜分析。所以樣品處理過(guò)程中應(yīng)加入適當(dāng)?shù)某恋韯?/p>

沉淀樣品中干擾物質(zhì)的方法主要包括有機(jī)溶劑沉淀法［11］、鹽沉淀法［12］及酸堿沉淀法［11］。鑒于對(duì)操作人員的身體健康及沉淀效果的考慮，試驗(yàn)使用30.0g·L－1偏磷酸溶液。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)偏磷酸溶液用量會(huì)改變蟲草素的出峰時(shí)間，其出峰時(shí)間隨偏磷酸溶液用量的增加而減少。這會(huì)導(dǎo)致蟲草素不能和雜質(zhì)分離，且在后續(xù)的色譜圖定量過(guò)程中造成處理軟件找不到對(duì)應(yīng)的目標(biāo)峰。試驗(yàn)確定30.0g·L－1磷酸溶液1.0mL已可沉淀樣品，且不對(duì)蟲草素的出峰時(shí)間和分離造成影響。

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)考察了SB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）、XDB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）和 Gemini C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）對(duì)目標(biāo)物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Gemini C18色譜柱可以很好地將蟲草素和雜質(zhì)分離，其他兩種色譜柱會(huì)存在基質(zhì)干擾。所以試驗(yàn)選擇Gemini C18色譜柱。

在最佳色譜條件下對(duì)空白基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽(yáng)性樣品進(jìn)行分析，其色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液和陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank matrix，standard solution and positive sample

由圖1可知，目標(biāo)物得到了很好的分離，沒(méi)有基質(zhì)干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

按試驗(yàn)方法對(duì)0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，1.00mg·L－1的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：蟲草素的質(zhì)量濃度在0.05～1.00mg·L－1內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝57.7 x，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)物的方法，以10倍信噪比計(jì)算得到蟲草素的測(cè)定下限（10S／N）為5.0mg·kg－1。

2.4 精密度與回收試驗(yàn)

取空白營(yíng)養(yǎng)品樣品若干份，分別加入蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中蟲草素的質(zhì)量比分別為5.0，40.0，60.0mg·kg－1，按試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率及測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表1可知：加標(biāo)回收率在100%～102%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～3.4%之間。

2.5 方法準(zhǔn)確性

使用NY／T 2116－2012中描述的方法對(duì)蟲草素原料進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)使用本方法分析添加了該蟲草素原料的營(yíng)養(yǎng)品，其中每54.8g營(yíng)養(yǎng)品中含1g蟲草素原料。

分別測(cè)定原料和營(yíng)養(yǎng)品各6次，取平均值。原料中蟲草素的質(zhì)量比為1.97mg·g－1，所以營(yíng)養(yǎng)品中蟲草素質(zhì)量比的理論值為35.95mg·kg－1。使用本方法實(shí)際測(cè)得營(yíng)養(yǎng)品中蟲草素的質(zhì)量比為35.32mg·kg－1。測(cè)定值和理論值的相對(duì)誤差為1.8%。

本工作建立了測(cè)定營(yíng)養(yǎng)品中蟲草素含量的方法，對(duì)樣品前處理中的沉淀劑進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇30.0g·L－1偏磷酸溶液1.0mL作為沉淀劑。該方法穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確，適用于營(yíng)養(yǎng)品中蟲草素的測(cè)定。

［1］ PATERSON R R.Cordyceps－ a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory？［J］.Phytochemistry，2008，69（7）：1469－1495.

［2］ 蔡昭林，李楚華，王曉琦，等.蟲草素改善腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶及對(duì)海馬神經(jīng)元數(shù)量的影響［J］.華南師范大學(xué)（自然科學(xué)版），2012，44（3）：95－99.

［3］ 劉昌杰.蟲草素對(duì)體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞株A549惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)及其相關(guān)miRNA表達(dá)的關(guān)系［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，21（12）：1597－1600.

［4］ JEONG J W，JIN C Y，KIM G Y，et al.Anti－inflammatory effects of cordycepin via suppression of inflammatory mediators in BV2microglial cells［J］.International Immunopharmacology，2010，10（12）：1580－1586.

［5］ RUMA I M，PUTRANTO E W，KONDO E，et al.Extract of Cordyceps militaris inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth of human malignant melanoma cells［J］.International Journal of Oncology，2014，45（1）：209－218.

［6］ KUMAR H，SPANDANA M.Simultaneous extraction，determination and analysis of adenosine，cordycepin and other derivatives of cordycepssinensis of Nepal by new validated HPLC method［J］.Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry，2013，2（4）：43－45.

［7］ HUANG L F，LIANG Y Z，GUO F Q.Simultaneous separation and determination of active components in Cordycepssinensis and cordycepsmilitarris by LC／ESIMS［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical A－nalysis，2003，33：1155－1162.

［8］ YANG F Q，GE L Y，WAN H Y.Determination of nucleosides and nucleobases in different species of Cordyceps by capillary electrophoresis－mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical A－nalysis，2009，50：307－314.

［9］ 簡(jiǎn)利茹，杜雙田.HPLC與LC－MS／MS測(cè)定蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素的方法比較［J］.食品科學(xué)，2013，34（14）：276－279.

［10］ NY／T 2116－2012 蟲草制品中蟲草素和腺苷的測(cè)定.

［11］ 汪家春，徐軍，李兆蘭，等.HPLC測(cè)定冬蟲夏草中的蟲草素［J］.食品與藥品，2015，17（4）：263－266.

［12］ GILL B D，INDYK H E，KUMAR M C，et al.A liquid chromatographic method for routine analysis of 5′－mononucleotides in pediatric formulas［J］.Journal of AOAC International，2010，93（3）：966－973.