趙杏珍（ZHAO Xing-zhen），楊 靖（YANG Jing），2，趙建宏（ZHAO Jian-hong），2

（1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；2河北省臨床檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050000）

艱難梭菌是一種革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌。近年來(lái)由于高產(chǎn)毒株027／NAP1／BI型艱難梭菌在歐美地區(qū)的暴發(fā)流行，艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的嚴(yán)重程度和發(fā)病率急劇上升［1］。在美國(guó)，艱難梭菌已經(jīng)取代耐甲氧西林金黃色葡 萄 球 菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureu，MRSA）成為醫(yī)院感染的首要病原菌，因此其將艱難梭菌的威脅等級(jí)定為最高“緊急”級(jí)別。CDI的臨床表現(xiàn)可從無(wú)癥狀定植到輕度自限性腹瀉或重度假膜性腸炎甚至危及生命。其臨床癥狀的發(fā)生發(fā)展主要取決于兩個(gè)方面，一是艱難梭菌的毒力，二是宿主腸道微生物群及免疫反應(yīng)。毒素是艱難梭菌最主要的毒力因子，包括毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB），兩者均能滅活GTP結(jié)合蛋白，引發(fā)一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致腹瀉和腸炎［2－3］。此外，某些特殊型別的菌株如027／NAP1／BI還能產(chǎn)生二元毒素，與CDI的高發(fā)病率和病死率相關(guān)［4］。黏附是艱難梭菌另一項(xiàng)重要的毒力因素，參與黏附的物質(zhì)有很多，如艱難梭菌表面蛋白、鞭毛等均可參與細(xì)菌黏附過(guò)程［5－8］。不管是毒素還是細(xì)菌表面成分均可引起免疫反應(yīng)，如炎性介質(zhì)釋放、免疫效應(yīng)細(xì)胞趨化等。腸道微生物群在CDI過(guò)程中也是至關(guān)重要的，一旦微生物群平衡被破壞，便可促進(jìn)腸道內(nèi)艱難梭菌芽孢的萌發(fā)、生長(zhǎng)、繁殖、定植、產(chǎn)毒。目前，在中國(guó)和其他許多亞洲國(guó)家，CDI尚未引發(fā)暴發(fā)流行，但人們對(duì)CDI的重視程度不夠，國(guó)內(nèi)關(guān)于CDI的研究數(shù)據(jù)非常有限。因此，本文就艱難梭菌的致病過(guò)程及腸道微生物群和免疫反應(yīng)在CDI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用作以綜述。

1 CDI的致病過(guò)程

腸道微生物群失衡為CDI創(chuàng)造了有利條件，其致病過(guò)程可分為以下步驟：芽孢經(jīng)糞－口途徑進(jìn)入腸道，繼而萌發(fā)成繁殖體；繁殖體生長(zhǎng)繁殖，并定植于腸道；艱難梭菌分泌毒素A和B，個(gè)別型別的艱難梭菌還可以產(chǎn)生二元毒素。毒素A和毒素B均為單糖基轉(zhuǎn)移酶，分別由tcdA和tcdB基因編碼，兩者均可滅活 Rho GTP酶家族中的Rho、Rac及Cdc4，從而破壞細(xì)胞骨架及緊密連接，使細(xì)胞變圓、破裂、死亡［2］。這一過(guò)程可嚴(yán)重?fù)p傷上皮細(xì)胞屏障的完整性，使其通透性增加、液體分泌增多，從而損傷腸道。與此同時(shí)，毒素還能誘發(fā)一系列免疫反應(yīng)。免疫細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)趨化中性粒細(xì)胞聚集，進(jìn)一步損傷腸道，最終導(dǎo)致腹瀉和腸炎［3］。

黏附功能在定植及致病過(guò)程中也起著重要作用。介導(dǎo)艱難梭菌和腸道相互作用的主要物質(zhì)是細(xì)菌表面蛋白，也叫細(xì)胞壁蛋白（cell wall protein，Cwp），包括S層蛋白（S-layer protein，SLP）、黏附素Cwp66和半胱氨酸蛋白酶Cwp84等。SLP是細(xì)菌表面最主要的物質(zhì)，能夠在細(xì)菌表面緊密排列形成晶體層，SLP又分為低分子量SLP（low-molecular weight S-layer protein，LMW-SLP）和高分子量SLP （high-molecular weight S-layer protein，HMW-SLP）。前者暴露于細(xì)菌表面參與黏附過(guò)程；后者固定于細(xì)胞壁，可結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白Ι、血小板反應(yīng)蛋白和玻璃體結(jié)合蛋白等，促進(jìn)艱難梭菌結(jié)合到人體腸道［6］。半胱氨酸蛋白酶Cwp84同樣位于細(xì)菌表面，其N(xiāo)端有蛋白水解位點(diǎn)，C端錨定在細(xì)胞壁上。Cwp84能將前體SlpA（S-layer proteinA，SlpA）分解為上述兩種 SLPs。此外，它還能降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如纖維蛋白、層黏連蛋白和玻璃體結(jié)合蛋白，促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散［7］。Cwp66蛋白也具有黏附功能，其C端暴露于細(xì)菌表面，具有高度變異性和免疫原性，N端錨定于細(xì)胞壁，菌種間保守。其他表面蛋白還包括：纖維連接蛋白結(jié)合蛋白Fbp68，位于細(xì)菌表面，參與細(xì)菌黏附于纖維連接蛋白和上皮細(xì)胞，不同菌種間保守并有高度免疫原性［6］；熱休克蛋白GroEL是細(xì)菌熱休克后釋放到細(xì)胞外的一種物質(zhì)，菌種間高度保守，具有細(xì)胞黏附作用［8］；膠原蛋白結(jié)合蛋白CbpA的N端有膠原結(jié)合位點(diǎn)，位于細(xì)菌表面［9］；脂蛋白具有高度黏附能力和免疫原性［10］。

此外，艱難梭菌還可分泌一些蛋白促進(jìn)其擴(kuò)散，如分泌型鋅金屬蛋白酶能清除宿主體內(nèi)某些蛋白，如IgA抗體、纖維蛋白原及纖維連接蛋白，破壞體內(nèi)纖連蛋白網(wǎng)［11－12］。另外，許多艱難梭菌都具有運(yùn)動(dòng)力。艱難梭菌的鞭毛不僅參與定植、黏附和生物膜形成等過(guò)程，還具有免疫原性［13］。

2 腸道微生物群在CDI過(guò)程中的作用

抗菌藥物暴露、年齡、炎癥性腸病、化學(xué)治療、使用質(zhì)子泵抑制劑等都是引發(fā)CDI的危險(xiǎn)因素［14］，且這些危險(xiǎn)因素均與腸道菌群多態(tài)性及種類(lèi)的改變有關(guān)，提示腸道微生物群在CDI過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，主要包括兩點(diǎn)：定植抵抗和代謝調(diào)節(jié)。

2.1 腸道微生物群的定植抵抗作用 腸道微生物群可以有效抵抗艱難梭菌定植、擴(kuò)散。正常小鼠腸道內(nèi)微生物種類(lèi)高達(dá)60種，其中擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)數(shù)量最多。目前，尚未確定真正發(fā)揮定植抵抗作用的特異性菌種。但研究［15］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)克林霉素處理后的小鼠，其腸道微生物群中發(fā)生明顯改變的菌種有腸桿菌科、腸球菌屬、毛螺菌科，提示以上3科／屬菌種可能與定植抵抗相關(guān)。腸道微生物群對(duì)艱難梭菌的定植抵抗包括直接作用和間接作用。前者指共生菌與艱難梭菌之間的直接作用，如競(jìng)爭(zhēng)生存空間、營(yíng)養(yǎng)素或者共生菌分泌細(xì)菌素抑制艱難梭菌定植［16-20］。如 Rea等［20］通過(guò) 對(duì)人體 末 端 結(jié) 腸 模型的研究發(fā)現(xiàn)蘇云金菌素CD對(duì)艱難梭菌有很好的抑制作用，同時(shí)對(duì)其他共生菌無(wú)影響，提示細(xì)菌素可以作為CDI新的治療方法。間接作用指腸道微生物群通過(guò)調(diào)節(jié)代謝影響艱難梭菌生長(zhǎng)。如腸道內(nèi)一些共生菌可以自由分泌唾液酸酶促使上皮細(xì)胞分泌唾液酸入腸道，唾液酸作為共生菌的能量來(lái)源被利用。而長(zhǎng)期服用抗菌藥物可使腸道內(nèi)共生菌豐度降低，唾液酸等代謝產(chǎn)物增多，從而促進(jìn)艱難梭菌的生長(zhǎng)［16］。以上研究均證明腸道微生物群與艱難梭菌定植之間有著緊密的聯(lián)系，但是兩者之間具體明確的關(guān)系尚不清楚。Buffie等［21］通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型對(duì)抗菌藥物處理的小鼠模型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Scindens梭菌與艱難梭菌定植高度相關(guān)。Kinnebrew等［14］采用相同的方法對(duì)一位接受造血干細(xì)胞移植的艱難梭菌腸炎患者的腸道菌群組分進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)Scindens梭菌與艱難梭菌定植密切相關(guān)?？赡苁且?yàn)镾cindens梭菌的染色體上有膽酸誘導(dǎo)操縱子（bile acid inducible，bai），能夠編碼脫羥基酶調(diào)節(jié)初級(jí)膽鹽轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽鹽［22］，而次級(jí)膽鹽可以抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)。再次證實(shí)了腸道微生物群在定植抵抗中的重要作用。

2.2 腸道微生物群的代謝調(diào)節(jié)作用

2.2.1 膽鹽代謝 除了上述定植抵抗機(jī)制外，腸道微生物群還可以通過(guò)調(diào)節(jié)代謝影響艱難梭菌的生長(zhǎng)。初級(jí)膽鹽，如?；悄懰岷透拾蹦懰幔瞧D難梭菌芽孢的萌發(fā)劑，可促進(jìn)芽孢轉(zhuǎn)化為繁殖體；相反，次級(jí)膽鹽鵝脫氧膽酸能抑制芽孢萌發(fā)［23］。研究［24］發(fā)現(xiàn)抗菌藥物作用后，微生物群的改變可以增加盲腸內(nèi)牛磺膽酸鹽含量，降低脫氧膽酸鹽含量從而促進(jìn)艱難梭菌萌發(fā)。Buffie等［21］將經(jīng)抗菌藥物處理后的小鼠盲腸內(nèi)容物移植到試驗(yàn)小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示艱難梭菌在其體內(nèi)擴(kuò)散增強(qiáng)；將不經(jīng)處理的且次級(jí)膽鹽含量較多的小鼠盲腸內(nèi)容物移植到試驗(yàn)小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該小鼠對(duì)艱難梭菌的抵抗能力增強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)移植四種菌也可以達(dá)到抵抗能力增強(qiáng)的效果，其中最重要的就是Scindens梭菌。以上結(jié)果均可證實(shí)膽鹽代謝在艱難梭菌生長(zhǎng)繁殖中的重要作用。

2.2.2 碳水化合物發(fā)酵 腸道微生物發(fā)酵食物可以生成短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），如乙酸、丙酸、丁酸等。有研究［25］發(fā)現(xiàn)在服用抗菌藥物的人體內(nèi)或者是經(jīng)抗菌藥物處理的動(dòng)物模型中，短鏈脂肪酸含量均減少，提示短鏈脂肪酸可能與CDI有關(guān)。具體機(jī)制可能有兩種：一是當(dāng)短鏈脂肪酸濃度降低時(shí)，pH值升高，提示短鏈脂肪酸可能是通過(guò)改變腸道的pH值進(jìn)而影響艱難梭菌的生長(zhǎng)；二是通過(guò)丁酸發(fā)揮作用。丁酸具有抗炎作用，能夠降低細(xì)胞通透性，從而增加腸道內(nèi)抗菌肽含量和黏液量，毛螺菌科和疣微菌科均能產(chǎn)生丁酸，并且這兩種菌科在住院的CDI高危人群以及CDI患者糞便中均顯著減少［26－29］。目前，一些研究雖然都通過(guò)動(dòng)物模型對(duì)短鏈脂肪酸在CDI中的作用進(jìn)行了評(píng)估，但結(jié)果卻不盡相同。其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步確證。

2.3 腸道微生物群與CDI的治療 腸道微生物群除了能夠很好地降低宿主艱難梭菌感染的敏感性外，還可以治療CDI。糞便菌群移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）就是將健康人的糞便處理后再移植到CDI患者腸道內(nèi)，用于修復(fù)患者腸道微生物群的失衡，從而達(dá)到治療CDI的作用。此外，F(xiàn)MT治療后患者腸道微生物群穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)還可以防止萬(wàn)古霉素治療后CDI的復(fù)發(fā)。目前關(guān)于FMT的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)較為熱門(mén)，一項(xiàng)來(lái)自新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志的報(bào)道［30］顯示，F(xiàn)MT用于治療復(fù)發(fā)性CDI患者的治愈率高達(dá)90%，再次證實(shí)了腸道微生物群對(duì)艱難梭菌的抵抗和治療作用。但是對(duì)于初發(fā)性CDI，F(xiàn)MT的治療效果如何尚不清楚。另外，移植未知菌種后給患者帶來(lái)的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)尚不可知。因此，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)MT未來(lái)的發(fā)展方向應(yīng)該是快速的靶向細(xì)菌治療，即鎖定某一種或者幾種已知的菌種治療CDI，不僅可以重新恢復(fù)正常菌群，還可以最大程度地限制副作用。Zhang等［31］采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)不同人群進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀攜帶者糞便樣本中變形菌門(mén)較CDI患者少，但是雙歧桿菌科豐度很高，而雙歧桿菌在CDI患者糞便樣本中是絕對(duì)缺乏的。這些數(shù)據(jù)提示相比于整個(gè)腸道微生物群的多態(tài)性，某種微生物種類(lèi)的存在或缺失對(duì)于判斷CDI敏感性或治療更重要。但由于腸道微生物群在不同個(gè)體間的差異使得尋找到具有CDI生物標(biāo)記作用或具有定植抵抗作用特定菌種的過(guò)程更具挑戰(zhàn)性。

3 免疫反應(yīng)在艱難梭菌感染過(guò)程中的雙重作用

宿主對(duì)抗艱難梭菌有3道防線：腸道上皮細(xì)胞屏障、固有免疫屏障、獲得性免疫屏障。艱難梭菌在腸道定植后釋放毒素A和毒素B破壞上皮細(xì)胞屏障，隨后毒素可直接作用于黏膜細(xì)胞和免疫細(xì)胞，激活炎癥信號(hào)引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激腸道上皮細(xì)胞釋放炎癥因子，如白細(xì)胞介素（IL）-8、γ干擾素（IFN-γ）、炎癥性巨噬細(xì)胞蛋白-2（MIP-2）、前列腺素2（PGE 2）、生長(zhǎng)相關(guān)原癌基因（GROα）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）［32］。與此同時(shí)，艱難梭菌表面蛋白被宿主腸道內(nèi)蛋白識(shí)別受體識(shí)別，兩者結(jié)合后刺激免疫細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IFN-γ，最終這些促炎癥因子和趨化因子能夠使中性粒細(xì)胞、免疫細(xì)胞及防御因子聚集，從而引發(fā)一系列免疫反應(yīng)。適應(yīng)性免疫反應(yīng)是抵抗艱難梭菌的最后一道防線，毒素及艱難梭菌表面蛋白都可以引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，如抗表面蛋白和毒素A的IgG、抗毒素B的IgA等［32］，從而更好的保護(hù)宿主。目前針對(duì)艱難梭菌毒素的類(lèi)毒素疫苗正在研究中，用于保護(hù)宿主腸道上皮細(xì)胞免于毒素?fù)p傷。一直以來(lái)CDI過(guò)程中宿主免疫反應(yīng)所起作用的利弊均有爭(zhēng)議，最新研究表明其保護(hù)性和致病性同時(shí)存在。

3.1 免疫反應(yīng)的保護(hù)作用 免疫反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是一

種自我保護(hù)的防御機(jī)制。非特異性免疫細(xì)胞和免疫因子的聚集以及特異性抗體的釋放在CDI過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。許多CDI動(dòng)物模型的研究結(jié)果均顯示免疫系統(tǒng)的缺失對(duì)機(jī)體本身是不利的［33］。瘦素（leptin，LP）是一種和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的激素，能夠增強(qiáng)機(jī)體清除艱難梭菌的能力，以及增加免疫調(diào)節(jié)因子釋放的作用。此外，固有淋巴細(xì)胞，特別是1群淋巴細(xì)胞釋放的γ-干擾素，Ⅰ型促炎性細(xì)胞因子能夠降低CDI患者的病死率，IL-22、17型促炎性細(xì)胞因子能夠提高CDI患者的存活率。此外IL-22還能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬作用，限制病原菌轉(zhuǎn)移［34－35］。以上結(jié)論均可證實(shí)免疫反應(yīng)在CDI過(guò)程的有利作用。

3.2 免疫反應(yīng)的致病作用 適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，但是當(dāng)免疫反應(yīng)過(guò)激時(shí)同樣也可以對(duì)機(jī)體造成損傷。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是毒素刺激機(jī)體后產(chǎn)生的，ROS能夠參與信號(hào)通路介導(dǎo)生成IL-8等免疫因子，但是ROS本身也能損傷腸道［36］。Feghaly等［38］通過(guò)檢測(cè) CDI患者糞便中的細(xì)胞因子含量發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱和CDI的嚴(yán)重程度及持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。近期相關(guān)研究［37－38］也表明體內(nèi)一些炎性標(biāo)志物的增多可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者的不良預(yù)后。例如趨化因子配體-5（CXCL5）和IL-8作為免疫調(diào)節(jié)因子，能趨化中性粒細(xì)胞，但是CXCL5和IL-8水平增高也可減緩CDI患者病情的康復(fù)。此外，IL-8表達(dá)增多與CDI復(fù)發(fā)增加相關(guān)，再次證明過(guò)度的免疫反應(yīng)會(huì)加重CDI。Buonomo等［39］的研究證實(shí)了細(xì)胞因子IL-23也能夠增加CDI的嚴(yán)重程度，該研究發(fā)現(xiàn)，缺乏IL-23的小鼠，其CDI的致病率和病死率明顯下降，提示CDI過(guò)程中，IL-23能夠擾亂免疫環(huán)境，造成腸道損傷。總之，以上研究均證實(shí)在CDI過(guò)程中，一些免疫因子確實(shí)能對(duì)機(jī)體造成更嚴(yán)重的損傷。因此，從免疫反應(yīng)過(guò)程中尋找治療CDI的突破點(diǎn)成為當(dāng)前炙手可熱的研究方向。例如通過(guò)激活或者抑制固有免疫反應(yīng)中某種信號(hào)通路達(dá)到減少有害炎癥因子的釋放等。

4 總結(jié)和展望

CDI在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為臨床、公共衛(wèi)生和基礎(chǔ)研究等多個(gè)領(lǐng)域廣為關(guān)注的問(wèn)題。更多地了解CDI過(guò)程能夠?yàn)楹罄m(xù)的預(yù)防和治療提供新的思路。長(zhǎng)期使用抗菌藥物可以對(duì)腸道菌群造成不可估量的損害，所以臨床應(yīng)嚴(yán)格把控抗菌藥物的使用指征。此外，F(xiàn)MT、干預(yù)免疫反應(yīng)通路、類(lèi)毒素疫苗等都為CDI的治療和預(yù)防帶來(lái)了新的曙光。