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        抑制NANOG表達(dá)對人食管鱗癌Eca-109干細(xì)胞增殖的影響

        2018-01-21 11:38:46鄧麗向小聰張若蘭劉康馮剛
        關(guān)鍵詞:鱗癌食管癌干細(xì)胞

        鄧麗 向小聰 張若蘭 劉康 馮剛

        我國是食管癌的高發(fā)區(qū),年平均死亡人數(shù)約15萬,占全國腫瘤死亡率21.8%[1],由于細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥的產(chǎn)生使目前該病的主要治療方法,即聯(lián)合性的綜合治療,療效不甚樂觀,食管癌的死亡率處于很高的水平[2-4]。因此,探尋食管癌的發(fā)生機(jī)制、尋找其早期腫瘤標(biāo)志物對于提高該病的早期診斷及治療具有重要意義。腫瘤干細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞群體中數(shù)量極少且特殊的一部分細(xì)胞,它們有完成細(xì)胞自我更新及分化、成瘤性強(qiáng)和抗凋亡等特性,在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。腫瘤干細(xì)胞對臨床上常用的放化療極為敏感且耐受性強(qiáng),因此它們是引起腫瘤復(fù)發(fā)及耐藥性形成的重要原因之一,也是導(dǎo)致治療最終失敗的重要因素,因而如果能提出針對食管癌干細(xì)胞的基因治療手段,就有望實(shí)現(xiàn)對食管癌的控制。

        胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT3/4、SOX2以及NANOG等是維持干細(xì)胞自我更新、調(diào)控細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素[6]。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,轉(zhuǎn)錄因子NANOG在乳腺癌等多種腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá),同時(shí)各功能性實(shí)驗(yàn)也證明了在多種腫瘤組織中NANOG的異常表達(dá)與腫瘤浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8],但截至目前為止,它與食管癌干細(xì)胞自我更新間的關(guān)系還未見詳細(xì)報(bào)道。因此,本研究擬通過懸浮培養(yǎng)法分離培養(yǎng)食管癌干細(xì)胞,并通過基因沉默技術(shù)研究NANOG的表達(dá)與食管癌干細(xì)胞增殖間的關(guān)系。

        材料與方法

        一、材料

        NANOG1、2、NC-shRNA購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司,NANOG、GAPDH、CD133等引物均由成都豪乙生物科技有限公司合成,免疫印跡蛋白實(shí)驗(yàn)(Western-Blot)中相關(guān)試劑均購自美國Thermo公司,嘌呤霉素、Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑、qPCR Mix均購自美國Invitrogen公司,活死細(xì)胞染色試劑購自美國AAT Bioquest公司,細(xì)胞因子β-FGF、EGF購自美國PeproTech公司,DMEM/F12、細(xì)胞生長添加成分B27購自美國Gibco公司,胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、100X雙抗添加劑、0.25%胰蛋白酶均購自美國HyClone公司,NANOG、GAPDH抗體購自美國SANTA CRUZ公司,CD133抗體購自英國Abcam公司,人食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109為川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心凍存。

        二、方法

        1.懸浮培養(yǎng)法分離食管鱗癌干細(xì)胞并檢測:復(fù)蘇培養(yǎng)Eca-109食管鱗癌細(xì)胞,以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期,將其消化傳代并以無血清培養(yǎng)基(serumfree medium,SFM)重懸,1×105/ml密度接種于低黏附性10 cm培養(yǎng)板中,待食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞增殖形成腫瘤干細(xì)胞球,6 ~ 8 d后,將其收集并機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液,重懸于SFM,按1 : 5比例傳代于10 cm培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)、進(jìn)一步純化形成食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞球。SFM培養(yǎng)基成分:DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加B27(1 : 50)、EGF(20 ng/ml)、β-FGF(20 ng/ml)生長因子。

        分別提取成球前后細(xì)胞總RNA(逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA)和蛋白,進(jìn)行RT-PCR和Western-Blot檢測細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44分子及蛋白水平的表達(dá)。mRNA表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參照,實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行分析計(jì)算。CD133上游引物序列:5'-ACAA TTCACCAGCAACGAGTCC-3';CD133下游引物序列:5'-GACGCTTTGGTATAGAGTGCTCAG-3';CD44上游引物序列:5'-AGACAACCACAAGGA TGACTGATG-3';CD44下游引物序列:5'-TCCAG TTTCCTTCATAAGCAGTGG-3';GAPDH上游引物:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3';GAPDH下游引物:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。Western-Blot法檢測蛋白表達(dá):提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行蛋白分離。PVDF膜電轉(zhuǎn)移后,封閉45 min,加入CD133、CD44和GAPDH一抗抗體,4 ℃過夜后洗滌,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗抗體。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色,膠片曝光檢查蛋白表達(dá)水平,以GAPDH作為內(nèi)參照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組培養(yǎng):懸浮培養(yǎng)得到的食管鱗癌干細(xì)胞分為如下3組,按照說明書要求,以脂質(zhì)體2000作為基因載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染:(1)無靶向mRNA的對照(NC)組;(2)靶向沉默NANOG的1號質(zhì)粒(sh-N1)組;(3)靶向沉默NANOG的2號質(zhì)粒(sh-N2)組。Sh-N1靶向序列:5'-TAAACTAC TCCATGAACAT-3';sh-N2靶向序列:5'-TGGAACA GTCCCTTCTATA-3'。各組轉(zhuǎn)染后,培養(yǎng)24 h后用含2.5 μg/ml嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)48 ~ 72 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        3. NANOG基因沉默及CD133、CD44表達(dá)檢測:提取方法2中轉(zhuǎn)染并篩選培養(yǎng)后細(xì)胞的總RNA(逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA)和蛋白,進(jìn)行RT-PCR和Western-Blot檢測NANOG的表達(dá)是否被有效敲低。并進(jìn)一步檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參照,實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行分析計(jì)算。NANOG上游引物:5'-ACCTATGCCTGTGATTTGTGG-3';下游引物:5'-AGTGGGTTGTTTGCCTTTGG-3'。Western-Blot方法同1,一抗抗體分別為NANOG和CD133。

        4.細(xì)胞增殖能力檢測:取方法2中各組轉(zhuǎn)染并篩選后的細(xì)胞,各實(shí)驗(yàn)組以2×104個細(xì)胞/孔重懸于200 μl培養(yǎng)基中,接種于96孔板。分組繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72和96 h后分別加入CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,酶標(biāo)儀測量450 nm波長的各孔吸光度(A)值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        5.活死細(xì)胞染色:取方法2中各組轉(zhuǎn)染并篩選后的細(xì)胞以及75%酒精(EtOH)孵育30 min的凋亡對照組細(xì)胞,消化、重懸將細(xì)胞接種于六孔板中,培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞3 ~ 5次,配置終濃度為1 μmol/L和2 μmol/L的Calcein-AM和PI染色液,500 μl染色液/孔加入細(xì)胞中,置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育15 min,顯微鏡下觀察并拍照記錄。

        6.腫瘤干細(xì)胞球形成能力檢測:取方法2中各組轉(zhuǎn)染并篩選后的細(xì)胞,將其消化傳代并重懸于SFM,同方法1中步驟進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞成球培養(yǎng)。拍照并對形成的細(xì)胞球計(jì)數(shù),整理數(shù)據(jù)比較NANOG表達(dá)水平的高低與食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞成球間的關(guān)系。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

        采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。RT-PCR表達(dá)水平、CCK-8實(shí)驗(yàn)測得A值、腫瘤干細(xì)胞球形成數(shù)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示,組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、懸浮培養(yǎng)法富集Eca-109腫瘤干細(xì)胞球

        以無血清的DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加EGF、β-FGF、B27生長因子,并輔以低黏細(xì)胞培養(yǎng)板降低食管鱗癌細(xì)胞的貼壁性。利用該條件從Eca-109食管鱗癌細(xì)胞系中成功獲得懸浮生長的腫瘤干細(xì)胞球,并可以連續(xù)傳代,如圖1。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與未分離的貼壁細(xì)胞相比(1.03±0.02,1.02±0.02),Eca-109干細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44表達(dá)明顯增強(qiáng)(10.12±0.19,9.21±0.26),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。Western-Blot實(shí)驗(yàn)與RT-PCR結(jié)果一致。結(jié)果如表1、圖2。

        表1 兩組Eca-109細(xì)胞CD133、CD44表達(dá)量(±s)

        表1 兩組Eca-109細(xì)胞CD133、CD44表達(dá)量(±s)

        注:實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

        分組CD133CD44

        圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察懸浮培養(yǎng)法獲得的Eca-109腫瘤干細(xì)胞球(×100)

        圖2 Western Blot檢測Eca-109 干細(xì)胞分離前后CD133、CD44蛋白表達(dá)水平

        二、三組食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞中NANOG表達(dá)水平比較

        RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),NANOG沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(sh-N1、sh-N2)食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞中NANOG的相對表達(dá)水平(0.18±0.01,0.23±0.01)較對照(NC)組(1.03±0.02)下調(diào),即NANOG shRNA有效沉默其mRNA表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。Western-Blot檢測與RT-PCR結(jié)果一致,NANOG shRNA有效沉默了NANOG蛋白水平的表達(dá),如圖3所示。

        三、NANOG敲低抑制食管鱗癌腫瘤干細(xì)胞增殖

        CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),sh-N1、sh-N2組Eca-109干細(xì)胞于24、48、72、96 h測得的A值分別為(0.33±0.02,0.52±0.04,0.61±0.06,0.81±0.03),(0.33±0.02,0.45±0.04,0.53±0.04,0.72±0.07),增殖能力低于NC組(0.90±0.01,1.41±0.01,2.31±0.02,3.12±0.07),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01,表2)。同時(shí),以酒精處理為陽性對照組的活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NANOG敲低并未引起細(xì)胞凋亡,如圖4所示。結(jié)果提示:NANOG敲低使Eca-109腫瘤干細(xì)胞增殖能力明顯降低。

        四、NANOG敲低抑制食管鱗癌細(xì)胞干細(xì)胞球形成能力

        圖3 Western Blot檢測NANOG shRNA轉(zhuǎn)染Eca-109干細(xì)胞后NANOG的蛋白表達(dá)水平

        對Eca-109腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行NANOG敲低操作后,在懸浮培養(yǎng)的條件下,sh-N1、sh-N2組富集腫瘤干細(xì)胞、形成腫瘤干細(xì)胞球的能力(12±1,16±2)低于對照NC組(80±3),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

        討 論

        食管癌在世界范圍內(nèi)是常見性的惡性腫瘤,并且仍在持續(xù)蔓延。據(jù)統(tǒng)計(jì),其5年生存率僅20%左右,中國年發(fā)患者數(shù)占全球總發(fā)病的60%[9-10]。目前,臨床上治療食管癌以根治性手術(shù)、放療、化療以及中醫(yī)藥治療為主要治療手段,并已取得了一定的治療效果,然而化療后細(xì)胞耐藥性出現(xiàn),并進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)等現(xiàn)象極為常見,這與腫瘤干細(xì)胞的存在密切相關(guān)。越來越多的研究在乳腺癌、前列腺癌、腦神經(jīng)瘤等惡性腫瘤中分離得到腫瘤干細(xì)胞,并證實(shí)它們參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-13]。隨著對腫瘤干細(xì)胞認(rèn)識的深入,針對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行治療以抑制腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的治療模式越來越受到重視。目前,對腫瘤干細(xì)胞的鑒定多依賴其表面標(biāo)志物,CD133、CD44是兩種被廣泛認(rèn)可的人腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[14-16]。本研究采用懸浮培養(yǎng)的方法分離Eca-109食管鱗癌干細(xì)胞,經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)測定,培養(yǎng)所形成的腫瘤干細(xì)胞球CD44、CD133的陽性率高達(dá)85.2%和91%,表明該方法高效地分離出食管鱗癌干細(xì)胞。

        表2 三組Eca-109干細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)測得的(A)值比較(±s)

        表2 三組Eca-109干細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)測得的(A)值比較(±s)

        注:實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

        分組24 h48 h72 h96 h NC組0.90±0.011.41±0.012.31±0.023.12±0.07 sh-N1組0.33±0.020.52±0.040.61±0.040.81±0.03 sh-N2組0.33±0.020.45±0.040.53±0.040.72±0.07 F值1121.33525.731022.161198.29 P值< 0.01< 0.01< 0.01< 0.01

        圖4 熒光顯微鏡下觀察NANOG敲低后細(xì)胞存活及凋亡情況(Calcein-AM/PI活死細(xì)胞染色,×100)

        NANOG是維持胚胎干細(xì)胞自我更新最為靈敏的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一,被視為胚胎干細(xì)胞重要的“看門人”,其表達(dá)量一旦下調(diào)就會導(dǎo)致細(xì)胞分化[17-19]。腫瘤細(xì)胞,尤其是低分化腫瘤細(xì)胞,與干細(xì)胞相似,具有自我更新和分化增殖的能力,在多種惡性腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)NANOG參與腫瘤干細(xì)胞調(diào)控,并在腫瘤的侵襲、遷移及耐藥中發(fā)揮重要作用[19]。研究者發(fā)現(xiàn)NANOG在食管癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),同樣,在食管鱗癌中也分離出得到腫瘤干細(xì)胞[8][20],但NANOG在食管鱗癌干細(xì)胞中的作用尚不明確。本研究利用RNA干擾技術(shù),將NANOG作為靶點(diǎn)對食管鱗癌干細(xì)胞的功能進(jìn)行干預(yù)。

        本研究采用NANOG 短發(fā)夾RNA(shRNA)轉(zhuǎn)染Eca-109食管鱗癌干細(xì)胞,以探究它對食管鱗癌干細(xì)胞增殖的影響。筆者首先通過RTPCR和Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中NANOG的mRNA及蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與對照(NC組)相比,所采用的NANOG shRNA有效的降低了細(xì)胞中NANOG的表達(dá)水平?;诖?,本研究進(jìn)一步采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測食管鱗癌干細(xì)胞增殖能力,同時(shí)采用懸浮培養(yǎng)方法檢測細(xì)胞成球能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照(NC組)相比,轉(zhuǎn)染NANOG shRNA后的食管鱗癌干細(xì)胞增殖和成球能力明顯減弱。既往研究也表明,NANOG在膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá),并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的積極作用[8][21-22]。

        綜上所述,敲低NANOG對Eca-109食管鱗癌干細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制效果,有望成為針對食管鱗癌的有效靶向性治療靶點(diǎn),提高食管鱗癌基因治療效果。

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