黃建華　何志剛　胡滸

摘 要：本文對(duì)黃顙魚腸道病原拮抗性芽孢桿菌的合理應(yīng)用及篩選的研究，從芽孢桿菌概況入手，分析黃顙魚腸道中對(duì)病原拮抗性芽孢桿菌的篩選，然后闡述病原拮抗性芽孢桿菌在水產(chǎn)中應(yīng)用，為水產(chǎn)品的生產(chǎn)安全與魚類的健康養(yǎng)殖提供一定的幫助，對(duì)益生菌在黃顙魚配合飼料中合理應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)鍵詞：黃顙魚；病原拮抗性芽孢桿菌；抗菌性；合理應(yīng)用；篩選

中圖分類號(hào)：S943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20171233116

近幾年，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，漁民為了追求更多的利潤(rùn)，而長(zhǎng)期濫用藥物，這不但使耐藥性細(xì)菌增加而影響水產(chǎn)業(yè)食品安全，還威脅了自然環(huán)境的安全，甚至是帶來(lái)嚴(yán)重的社會(huì)問題。而黃顙魚作為我國(guó)重要的淡水魚類，黃顙魚腸道中病原拮抗性芽孢桿菌可分泌抗菌物質(zhì)，有效解決了現(xiàn)有生物抗生素耐藥性問題，并且不會(huì)污染環(huán)境及對(duì)人類造成傷害。

1 芽孢桿菌概況

芽孢桿菌屬于菌科，其對(duì)外界有害因子抵抗力較強(qiáng)，分布比較廣，存在水、空氣及動(dòng)物腸道等，具有產(chǎn)酶種類多、生物活性強(qiáng)等性質(zhì)，其對(duì)植物性碳水化合物降解能力突出[1]。芽孢桿菌特征是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)生孢子，形狀為圓形、弧形，具有高光學(xué)反射性，物理特性穩(wěn)定，是一種處于休眠狀態(tài)的活細(xì)胞，特點(diǎn)為耐受高溫高壓、抗性強(qiáng)及不變質(zhì)等，屬于兼性厭氧菌，存活率比較高，易于進(jìn)行培養(yǎng)。在制劑中芽孢桿菌以內(nèi)生孢子形態(tài)存在，可耐受飼料加工、儲(chǔ)藏，其飼料用后在腸道環(huán)境中穩(wěn)定極高，而孢子進(jìn)入腸道后則可以迅速?gòu)?fù)活。

2 黃顙魚腸道病原拮抗性芽孢桿菌的篩選

由于黃顙魚腸道中存在大量的桿菌，而如何將有益的病原拮抗性芽孢桿菌進(jìn)行利用，就要對(duì)其進(jìn)行篩選，其主要分為指示菌、芽孢桿菌的分離與純化、病原拮抗菌篩選及芽孢桿菌的鑒定，將有益的病原拮抗性芽孢桿菌進(jìn)行使用，從而促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，以下是具體的內(nèi)容。

2.1 指示菌

選擇健康的黃顙魚，體重為30～50g，該魚的體表與體內(nèi)在解剖后，均無(wú)出現(xiàn)出血與充血情況，且腸道無(wú)明顯的食糜情況。對(duì)于腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基，采用源于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。將草魚的柱狀嗜纖維菌與嗜水氣單胞菌、鰻鱺養(yǎng)殖水體的遲緩愛德華氏菌及羅非魚的溫和氣單胞菌進(jìn)行分離，保存大腸桿菌在本單位。

2.2 芽孢桿菌的分離與純化

采用無(wú)菌方法，將取0.5g黃顙魚腸斷組織，均漿，加無(wú)菌生理鹽水4.5mL制成原液，待稀釋10倍后進(jìn)行使用。將細(xì)菌懸液稀釋后放于80℃水浴中，并進(jìn)行15min的處理。然后在腦心浸液體培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，溫度保持在37℃，增菌進(jìn)行培養(yǎng)24h。待梯度稀釋后，在 BHI 平板上涂布0.1mL菌液進(jìn)行培養(yǎng)。隨機(jī)對(duì)菌落挑取，純化后接種斜面，在培養(yǎng)后進(jìn)行保存?zhèn)溆茫囟葹?7℃）。以革蘭氏染色與氧化酶的試驗(yàn)每株菌，保留陽(yáng)性芽孢桿菌。

2.3 篩選病原拮抗菌

對(duì)于病原拮抗菌的篩選，需要采用牛津杯法，活化24h芽孢桿菌和指示菌。待離心洗滌后調(diào)整濃度為 106cfumL。在BHI平板上進(jìn)行涂布，以吸取0.1mL指示菌菌液為基礎(chǔ)，用無(wú)菌鑷子，將滅菌后牛津杯取出，置于其上，待輕壓后，使杯底與培養(yǎng)基緊貼。加入0.2mL芽孢桿菌菌液于每個(gè)牛津杯中，將皿置放置30℃恒溫進(jìn)行培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈的直徑，包括牛津杯直徑，將此實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

2.4 鑒定芽孢桿菌

在培養(yǎng)細(xì)菌活化24h后，觀察菌落的形態(tài)，然后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢芽孢以率和形態(tài)形成。采用API50CHB試劑盒（法國(guó)生物梅里埃公司）進(jìn)行鑒定。

3 黃顙魚腸道病原拮抗性芽孢桿菌的合理利用

黃顙魚腸道中存在大量的桿菌，而對(duì)病原拮抗性芽孢桿菌在水產(chǎn)中應(yīng)用，主要依靠枯草芽孢桿菌。由于枯草芽孢桿菌成桿狀，在水體或飼料中進(jìn)行添加，而芽孢桿菌具有很強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶活性及脂肪酶，可抑制或殺滅水體中或生物體內(nèi)的一些有害致病菌，使有益菌的群落增強(qiáng)，飼料轉(zhuǎn)化率提高8%以上，促進(jìn)魚類生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)防治水產(chǎn)疾病。

4 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)黃顙魚腸道病原拮抗性芽孢桿菌的合理應(yīng)用及篩選的研究，了解了芽孢桿菌的特點(diǎn)與功能，對(duì)其篩選，其主要分為指示菌、芽孢桿菌的分離與純化、病原拮抗菌篩選及芽孢桿菌的鑒定，對(duì)于病原拮抗性芽孢桿菌在水產(chǎn)中合理應(yīng)用，應(yīng)根據(jù)水產(chǎn)環(huán)境與魚類的實(shí)際情況，邀請(qǐng)相關(guān)的專家，待分析之后，進(jìn)行芽孢桿菌的應(yīng)用，這有利于水產(chǎn)品的生產(chǎn)安全與魚類的健康養(yǎng)殖，對(duì)在黃顙魚配合飼料中添加益生菌應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]職愛民，賈國(guó)超，鄭春華，等.芽孢桿菌作為微生物飼料添加劑的功能及其應(yīng)用[J].飼料與畜牧，2014（5）：41-44.endprint