徐豐清，張 磊，劉明鷺

（1.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，山東 青島 266500；2.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071）

1 儀器與試藥

BUCH B-K314型定氮儀；0.005141 mol/L硫酸滴定液；人血白蛋白（批號：4312100816，規(guī)格：20%，50 mL，生產(chǎn)廠家：瑞士杰特貝林生物制品有限公司）；氯化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸、鎢酸鈉等，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定按照中國藥典2015年版三部[1]人血白蛋白品種項(xiàng)下規(guī)定，具體測定方法按照《中國藥典》2015年版四部通則0731蛋白質(zhì)含量測定法的測定法（2）[2]操作，照鎢酸沉淀法制備非蛋白氮供試品溶液。然后僅以定氮儀作為蒸餾裝置，其他按照0704氮測定法第二法（半微量法）進(jìn)行。

總氮供試品溶液的制備：精密量取樣品1 mL，置25 mL量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

非蛋白氮供試品溶液的制備：精密量取樣品1 mL，置25 mL量瓶中，加水10 mL，加10%鎢酸鈉溶液2.5 mL，加0.33 mol/L的硫酸溶液2.5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻。靜置30 min，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

分別精密量取總氮供試品溶液和非蛋白氮供試品溶液各1 mL，置凱氏定氮瓶中，進(jìn)行后續(xù)消化和蒸餾等操作。

接收液中加入5滴甲基紅-溴甲酚綠指示液。溜出液用0.005141 mol/L的硫酸滴定液滴定。同時進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，并在結(jié)果中加以校正。

2.2 數(shù)學(xué)模型（見圖1）

式中，Y為蛋白質(zhì)的含量（mg/g）；V總氮、V非蛋白氮為樣品消耗滴定液的體積（mL）；V0總氮、V0非蛋白氮為空白消耗滴定液的體積（mL）；F為硫酸滴定液的校正因子（0.005141/0.005）；1.401為折成氮原子的滴定度（mg/mL）；6.25為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；稀釋倍數(shù)為供試品稀釋倍數(shù)；M樣為樣品取樣量（mL）；標(biāo)示量為20%（20mg/100mL）。

2.3 測量不確定度的來源

2.3.1 移液管帶入的不確定度

V移（mL）：轉(zhuǎn)移溶液溫度近20℃（以空調(diào)控制），溫度影響可忽略。1 mL移液管的MPE=±0.007 mL，按矩形分布評定：u（移V）=0.007/=0.00404 mLurel（移V）=0.00404/1×100%=0.404%。

2.3.2 容量瓶帶入的不確定度

V容（mL）：配制溶液溫度近20℃（以空調(diào)控制），溫度影響可忽略。25 mL容量瓶的MPE=±0.03 mL，按矩形分布評定：u（容V）=0.03/=0.0173 mL，urel（容V）=0.0173/25×100%=0.0692%。

2.3.3 滴定帶入的不確定度

滴定時溶液溫度近20℃（以空調(diào)控制），溫度影響可忽略。

2.3.3.1 滴定樣品帶入的不確定度

25 mL滴定管MPE=±0.04 mL，按矩形分布評定：u（滴V）=0.04/=0.0231 mL。

因滴定樣品和空白各2次，共4次，故應(yīng)計(jì)算4次。V總氮=9.38 mL，V非蛋白氮=0.66 mL，V0總氮=0.70 mL，V0非蛋白氮=0.59 mL，（V總氮-V0總氮）-（V非蛋白氮-V0非蛋白氮）=8.61 mL。合成不確定度urel（滴V）=0.0462/8.61×100%=0.537%

2.3.3.2 滴定液帶入的不確定度

滴定液為0.005141 mol/L 的硫酸滴定液，由0.05141 mol/L的硫酸滴定液稀釋10倍而成，具體操作為精密量取10 mL，置200 mL量瓶中，稀釋至刻度。

滴定液按照20℃擴(kuò)展不確定度為0.05%（P=95%，k=2），所以urel（滴定液）=0.05%/2=0.025%。

20 mL移液管的MPE=±0.03 mL，u（移V）=0.03/=0.0173 mL，urel（移V）=0.0173/20×100%=0.0866%。

200 mL容量瓶的MPE=±0.15 mL，u（容V）=0.15/=0.0866 mL，urel（容V）=0.0866/200×100%=0.0433%。

滴定液帶入的總的合成不確定度：urel（總滴定液）=0.100%。

2.3.3.3 滴定終點(diǎn)偏差

甲基紅-溴甲酚綠指示液pH值變色點(diǎn)為5.1，酸度變化極微，終點(diǎn)判斷誤差可忽略不計(jì)。

綜上，滴定引起的總不確定度為：

2.3.4 重復(fù)性測定的不確定度

蛋白質(zhì)含量測定重復(fù)測定2次，結(jié)果分別為97.32%和97.87%，平均97.60%。

因測定次數(shù)少，標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算采用極差法，s=R/C，R為n次測定的極差，C是與n有關(guān)的系數(shù)，當(dāng)n=2時，C=1.13。因此，s=（97.87%-97.32%）/1.13=0.487%。

2.4 不確定度合成（見表1）

表1 不確定度一覽表

2.5 擴(kuò)展不確定度

U（rel）=urel×2=0.768%×2=1.54%（k=2），本次人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定不確定度評定結(jié)果：U=97.60%×1.54%=1.50%，本次人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果：，本品蛋白質(zhì)含量為標(biāo)示量的（97.6%±1.5%）（k=2）。

3 討 論

本次不確定度的評定中，樣品滴定、樣品量取和重復(fù)性測定是主要影響因素，樣品稀釋體積的影響較小。因人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定采用總氮減掉非蛋白氮的方法，樣品滴定需要2次，增加了測定的不確定度。人血白蛋白中蛋白質(zhì)含量測定法為半微量法定氮，量取體積較少，須使用1 mL移液管，故樣品量取因素對不確定度影響也較大。重復(fù)性測定也是不確定度較大的影響因素，提示實(shí)驗(yàn)過程中，要特別注意蛋白沉淀、消化、蒸餾等環(huán)節(jié)，一定要注意蛋白沉淀完全，消化完全，蒸餾充分。另外實(shí)驗(yàn)人員操作水平，儀器設(shè)備的先進(jìn)性，以及試劑等都是需要注意的因素。

[1] 中國藥典2015年版.三部[S].2015:244.

[2] 中國藥典2015年版.四部[S].2015:96.

[3] JJF1059.1-2012.測量不確定度評定與表示[M].北京:國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2012.