李 瑋，宋國(guó)琦，張榮志，李玉蓮，張淑娟，高 潔，李根英

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

小麥?zhǔn)鞘澜缟蟽H次于水稻的第二大糧食作物，種植范圍廣，總面積達(dá)2.2億hm2[1]，以面粉制品為主食的人口占世界人口的35%[2]。流行廣、危害重的銹病和白粉病是小麥生產(chǎn)中的主要病害，一旦發(fā)病，小麥產(chǎn)量嚴(yán)重降低，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。銹病分為條銹、葉銹和稈銹，分別由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)、隱匿柄銹菌(Pucciniatriticina，Pt)和禾柄銹菌小麥?；?Pucciniagraminisf. sp.trtici，Pgt)引起；白粉病由禾本科布氏白粉菌小麥專化型(Blumeriagraminisf. sp.tritici，Bgt)引起[3]。當(dāng)前，選育抗病品種是防治小麥銹病和白粉病最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的途徑[4]。小麥的抗病性主要分為垂直抗性和水平抗性兩類(lèi)。垂直抗性又稱生理小種專化抗性、全生育期抗性等，由單基因控制，表現(xiàn)為從苗期至成株期均抗病，對(duì)病原菌侵染產(chǎn)生免疫或壞死反應(yīng)。但是在抗病品種的選擇壓力下，病原菌生理小種此消彼長(zhǎng)，抗病品種的抗性會(huì)逐步喪失。因此近年來(lái)人們對(duì)水平抗性的研究和利用越來(lái)越多。水平抗性又稱部分抗性、非小種?；剐浴⒊芍昕剐缘?，由微效基因控制，苗期抗病性差，成株期則表現(xiàn)為慢病性，即病原菌侵入潛育期長(zhǎng)、孢子堆小、產(chǎn)孢量低等。水平抗性對(duì)病原小種無(wú)?；?，抗性持久。已經(jīng)命名的成株抗性基因包括抗葉銹基因Lr12-13、Lr22a/Lr22b、Lr34-35、Lr37、Lr46、Lr48-49、Lr67-68[5]，抗條銹基因Yr11-Yr14、Yr16、Yr18、Yr29、Yr30、Yr36、Yr39、Yr46、Yr48、Yr49、Yr52、Yr54、Yr59、Yr62[6]，抗稈銹基因Sr2、Sr55、Sr56、Sr57、Sr58[6]以及抗白粉基因Pm38、Pm39、Pm46[7]。大田條件下，小麥病害往往相互疊加，僅對(duì)一種病害具有抗性往往不能有效控制病害對(duì)產(chǎn)量的影響。在已發(fā)現(xiàn)的小麥成株抗性基因中有4個(gè)基因同時(shí)對(duì)3種銹病和白粉病具有抗性，即Lr27/Yr30/Pm？/Sr2、Lr34/Yr18/Pm38/Sr57、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55。多效抗病基因在國(guó)內(nèi)也被稱為一因多效基因、兼抗型成株抗性基因等。它們可以應(yīng)對(duì)生產(chǎn)上多病齊發(fā)的復(fù)雜大田環(huán)境，是珍貴的基因資源，如用于培育抗病品種事半功倍。

1 Lr27/Yr30/Pm？/Sr2基因研究進(jìn)展

1916年，McFadden[8]以六倍體硬紅春小麥Marquis選系為父本，與稈銹和葉銹免疫的四倍體二粒小麥Yaroslav選系雜交，后經(jīng)稈銹病抗性、品質(zhì)和產(chǎn)量選擇培育出小麥品種Hope。在Hope的3B染色體短臂上有1個(gè)隱性成株抗性基因Sr2[9-10]，含有該基因的小麥大田成株期表現(xiàn)為慢病性(指小麥植株雖不能完全阻止病菌入侵，但可減緩病害發(fā)展速度的一種抗病性)，與擬黑穎病(pseudo-black chaff)緊密連鎖[11]，也與幼苗黃化基因sc連鎖[12]。2014年，Sr2基因被定位至Hope 3B染色體867 kb區(qū)間，包含34個(gè)基因，據(jù)此預(yù)測(cè)Sr2不屬于NB-LRR基因家族，且不同于已經(jīng)克隆的Lr34和Yr36[13]。從19世紀(jì)40年代以來(lái)，Sr2在小麥中得到了廣泛使用，為小麥生產(chǎn)提供了持久廣譜抗性，在澳大利亞和國(guó)際小麥玉米改良中心等的小麥品種中大量存在[10]。

1971年，Rajaram等[14]在澳大利亞品種Timgalen中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)隱性抗葉銹病基因，將其暫時(shí)命名為L(zhǎng)rT，后被證明該基因與澳大利亞品種Gatcher中的抗葉銹基因相同[15]。1980年，Mcintosh[16]將Timgalen、Gatcher和Hope 3B染色體上的抗葉銹基因正式命名為L(zhǎng)r27，該基因與Sr2緊密連鎖，與位于4BS的Lr31基因?yàn)榛パa(bǔ)基因，即2個(gè)基因同時(shí)存在時(shí)才表現(xiàn)抗性[15,17]。Singh等發(fā)現(xiàn)3BS上的抗葉銹基因位點(diǎn)對(duì)條銹病也有作用[18]，被命名為Yr30[19]。Mago等[17]研究發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為連鎖的Lr27和Sr2可能是同一個(gè)基因，該基因還具有白粉病抗性(相應(yīng)的白粉病抗性基因符號(hào)尚未確定，本文用Pm？表示)，Sr2或者說(shuō)Pm？基因的白粉病抗性有待進(jìn)一步研究。Lr27、Sr2、Pm？和Yr30為同一個(gè)基因的直接證據(jù)也需要在Sr2基因克隆之后才能給出。

在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方面，Spielmeyer等[20]利用中國(guó)春和中國(guó)春Hope 3B代換系的F3群體構(gòu)建了3BS末端遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記gwm533可以作為Sr2的連鎖標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇。該標(biāo)記在含有Sr2的品種中擴(kuò)增出120 bp片段，在不含Sr2的品種中大部分?jǐn)U增出155 bp片段或無(wú)擴(kuò)增，個(gè)別擴(kuò)增出假陽(yáng)性120 bp片段。假陽(yáng)性片段的SSR重復(fù)堿基構(gòu)成與陽(yáng)性片段不同，可用STM標(biāo)記stm559tgag和stm598tcac區(qū)分[21]。根據(jù)Hope 3B染色體BAC跨疊群開(kāi)發(fā)的連鎖CAPS標(biāo)記csSr2，對(duì)不含Sr2小麥材料的檢測(cè)符合率為100%，對(duì)含有Sr2小麥材料的檢測(cè)符合率為95%(共檢測(cè)122份材料，115份符合)[22]。Rasheed等[23]根據(jù)csSr2的SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了KASP標(biāo)記Sr2_ger9 3p，提高了檢測(cè)效率。2014年，Mago等[13]將Sr2定位至Hope3B的867 kb區(qū)域，候選基因包括10個(gè)類(lèi)萌發(fā)素蛋白(Germin-Like Protein)，但在中國(guó)春的參考基因組序列中缺失。csSr2位于其中一個(gè)類(lèi)萌發(fā)素蛋白上，是已報(bào)道距離Sr2最近的分子標(biāo)記，該基因尚未被克隆。

2 Lr34/Yr18/Pm38/Sr57基因研究進(jìn)展

Lr34基因源自普通小麥，最早發(fā)現(xiàn)于加拿大品種Terenzio并被命名為L(zhǎng)rT2[24]，系譜追溯指向巴西品種Frontana，也有學(xué)者認(rèn)為，中國(guó)春可能是其最初來(lái)源，位于7D染色體短臂。Lr34是成株抗性基因，成株期表現(xiàn)為慢病性，在苗期也有一定抗性，溫度低時(shí)(日均溫0～20 ℃)抗性更好[10]。對(duì)葉斑病(Sb1)[25]、稻瘟病[3]、大麥黃矮病(Bdv1)[26]均有抗性，與干葉尖性狀(Ltn1)共分離[27]。有報(bào)道顯示，Lr34與其他基因組合可以顯著提高抗性和持久性[28-29]。由于Lr34對(duì)多種病害具有持久廣譜抗性，在世界范圍被廣泛應(yīng)用。

1992年，Singh[30]和Mcintosh[31]分別報(bào)道了含有Lr34基因的品種或回交品系具有葉銹病成株抗性，該抗葉銹基因被命名為Yr18，遺傳分析顯示Lr34和Yr18緊密連鎖。2005年，Spielmeyer等[32]發(fā)現(xiàn)Lr34基因抗感分離的重組自交系群體在成株期白粉病抗性也分離，遺傳作圖顯示控制白粉病抗性的基因與Lr34和Yr18共分離，該基因被命名為Pm38[33]。2008年，Bansal等[34]檢測(cè)到穩(wěn)定的QSr.Sun-7DS與Lr34位點(diǎn)重合，表明Lr34與抗稈銹有關(guān)，2011年，Hiebertd等[35]在對(duì)加拿大小麥品種Peace的研究也證實(shí)Lr34對(duì)稈銹病具有抗性，隨后將此抗稈銹基因命名為Sr57[36]。

2009年，Krattinger等[37]克隆了Lr34基因，該基因編碼ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其作用機(jī)理屬于防御性反應(yīng)，通過(guò)產(chǎn)生類(lèi)似衰老的葉片局部壞死而實(shí)現(xiàn)抗病。抗病與感病基因間存在3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，即第4內(nèi)含子的A/T顛換、第11外顯子的三堿基缺失和第12外顯子的C/T轉(zhuǎn)換[38]。隨后根據(jù)2個(gè)外顯子的堿基差異開(kāi)發(fā)了功能標(biāo)記cssfr1-cssfr6。在對(duì)功能標(biāo)記驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，Jagger和H45屬于感病品種，但檢測(cè)結(jié)果為抗病基因型。序列分析發(fā)現(xiàn)，Jagger的Lr34基因外顯子22上發(fā)生了G/T轉(zhuǎn)換產(chǎn)生提前終止密碼子，缺失了C端的185個(gè)氨基酸導(dǎo)致基因功能喪失。據(jù)此開(kāi)發(fā)了區(qū)分假陽(yáng)性Jagger類(lèi)型的CAPS標(biāo)記cssfr7[39]。2010年，Dakouri等[40]通過(guò)圖位克隆方法再次確認(rèn)了Lr34為ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，開(kāi)發(fā)了功能標(biāo)記caIND11并發(fā)現(xiàn)了稀有變異類(lèi)型。2016年，Rasheed等[23]開(kāi)發(fā)了檢測(cè)三堿基缺失和Jagger類(lèi)型G/T轉(zhuǎn)換的KASP標(biāo)記Lr34_TCCIND和Lr34jagger，提高了檢測(cè)效率。

3 Lr46/Yr29/Pm39/Sr58基因研究進(jìn)展

Lr46基因發(fā)現(xiàn)于國(guó)際小麥玉米改良中心(CIMMYT)小麥品種Pavon76，位于1B染色體長(zhǎng)臂，部分顯性，屬于成株抗性基因，但抗性效應(yīng)小于Lr34?；蚨ㄎ话l(fā)現(xiàn)，Lr46的連鎖AFLP標(biāo)記與1個(gè)抗條銹病基因也連鎖，將該抗條銹病基因命名為Yr29[41-42]。Lr46對(duì)葉斑病有抗性但效應(yīng)較小[25]，與干葉尖性狀(Ltn2)共分離[43]。2008年，Lillemo等[33]對(duì)CIMMYT小麥品種Saar進(jìn)行抗白粉病基因定位時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有Lr46/Yr29位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)具有白粉病抗性，將其命名為Pm39。2013年，Singh等[44]報(bào)道Lr46/Yr29/Pm39/Ltn2可能還具有稈銹病成株抗性，該基因被命名為Sr58[45]。雖然Lr46與Lr34很類(lèi)似，但是沒(méi)有證據(jù)表明它們所在的7DS和1BL發(fā)生過(guò)基因復(fù)制或染色體片段復(fù)制，兩者應(yīng)該是不同基因。

在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方面，利用連鎖標(biāo)記和小麥染色體缺失系Lr46被定位至1BL 0.84～0.89染色體區(qū)段，與水稻5L染色體有共線性關(guān)系。根據(jù)共線性區(qū)段的小麥EST開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，在Lalb×Lalb(PRL 1B)群體中篩選出XSTS1BL2和XSTS1BL17位于Lr46兩側(cè)各2.2 cM，XSTS1BL9與Lr46共分離[46]。Rosewarne等[43]在Lalb×Lalb.(Pavon 1B)和Lalb×Lalb.(Parula 1B)2個(gè)群體中發(fā)現(xiàn)STS標(biāo)記BAC17R距Lr46位點(diǎn)2～3 cM。根據(jù)SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的CAPS標(biāo)記cslv46可以有效區(qū)分抗病鑒定含或者不含Yr29的近等基因系，是目前檢測(cè)Lr46最有效的分子標(biāo)記[47-48]，該基因尚未被克隆。

4 Lr67/Yr46/Pm46/Sr55基因研究進(jìn)展

1979年，Dyck和Samborski[49]在編號(hào)PI250413的巴基斯坦普通小麥中發(fā)現(xiàn)1個(gè)成株抗條銹基因，通過(guò)回交法將該成株抗條銹基因?qū)隩hatcher獲得品系RL6077。由于與Lr34抗病反應(yīng)相似，被推測(cè)是Lr34的染色體易位。細(xì)胞學(xué)研究否定了7D染色體發(fā)生過(guò)易位，關(guān)聯(lián)分析在2個(gè)用RL6077組配的分離群體中檢測(cè)到4DL上存在葉銹和條銹成株抗性位點(diǎn)，其中葉銹成株抗性基因被命名為L(zhǎng)r67[50]。2011年，Herrea-Foessel等[51]利用RL6077與感病親本Svocet S組配的群體進(jìn)行了研究，驗(yàn)證了Lr67并確定Lr67與Lr34是不同基因，將與其共分離的抗條銹基因命名為Yr46，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Lr67/Yr46具有稈銹病抗性且與干葉尖性狀緊密連鎖，隨后他們又進(jìn)一步研究了RL6077抗稈銹、白粉病和干葉尖性狀的關(guān)系，結(jié)果表明，Lr67/Yr46具有稈銹和白粉病抗性，并且與干葉尖連鎖，將其對(duì)應(yīng)基因分別命名為Sr55、Pm46和Ltn3[52]。

2015年，Kolmer等[47]克隆了Lr67基因，該基因編碼一個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其作用機(jī)理為營(yíng)養(yǎng)限制，即通過(guò)抑制質(zhì)外體途徑的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)，使葉片中已糖比例升高，蔗糖比例下降，限制病菌對(duì)蔗糖的獲取，從而抑制病菌的生長(zhǎng)?？共∨c感病基因編碼的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白僅存在2個(gè)氨基酸的差異，對(duì)葡萄糖攝取具有顯性負(fù)效應(yīng)。該基因的抗病性可能是通過(guò)改變葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)減少葡萄糖攝取，從而減緩病菌生長(zhǎng)。根據(jù)差異氨基酸位點(diǎn)的DNA序列設(shè)計(jì)了TM4和TM10兩個(gè)SNP功能標(biāo)記，是用于分子標(biāo)記輔助選擇育種的理想標(biāo)記。

5 多效抗病基因的載體材料與利用情況

含有Sr2基因的原始材料為Hope和H44-24[8]，經(jīng)分子標(biāo)記csSr2檢測(cè)含有該基因的材料還包括Sunstate、Opata、Pastor、Pavon76等[22]；Lr34基因存在于PI58548、中國(guó)春、川麥18、RL6058、Frontana、Glenlea、Opata等小麥材料中[38，53]；Lr46基因發(fā)現(xiàn)于CIMMYT材料Pavon76[41]，含有該基因的材料還包括Attila、Parula、Saar等[33-43]；Lr67基因來(lái)源于編號(hào)PI250413的巴基斯坦小麥[49]，后被導(dǎo)入RL6077[50]，Sujata和NP876也含有該基因[54]。

楊文雄等[55]2008年對(duì)中國(guó)的231份小麥育成品種(系)進(jìn)行Lr34基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)14份攜帶Lr34基因，占6.1%。Zeng等[56]2014年對(duì)330個(gè)品種和164個(gè)高代系進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2.0%的材料含有Yr18基因。Ren等[57]2015年對(duì)84份品種或高代系進(jìn)行基因推導(dǎo)，認(rèn)為13份材料含有Lr27基因，占檢測(cè)總數(shù)的15.5%。劉金棟等[58]2015年對(duì)成株抗性高代品系進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)21份冬小麥中有3份含基因Sr2或Lr34或Lr46，沒(méi)有同時(shí)含2個(gè)以上基因的材料；96份春小麥中有9份同時(shí)含基因Lr34和Lr46，同時(shí)含基因Sr2和Lr46的有2份，同時(shí)含基因Sr2、Lr34和Lr46的僅1份。Moore等[54]2015年利用Lr67功能標(biāo)記對(duì)115個(gè)中國(guó)地方品種進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅3個(gè)品種含Lr67基因。劉理森等[23]2016年對(duì)241份小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)59份材料含基因Pm38，占24.5%。張亞琦[59]2016年對(duì)460份常見(jiàn)小麥品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)59份品種含基因Lr34，占12.8%，89份品種含基因Lr46，占19.3%，11份品種同時(shí)含這2個(gè)基因，占2.4%。Rasheed等[23]2016年對(duì)223份中國(guó)大面積種植的小麥品種進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6份品種含基因Lr34，占2.7%；69份品種含基因Sr2，占30.9%；4份品種同時(shí)含這2個(gè)基因，占1.8%。以上研究說(shuō)明，中國(guó)小麥育種材料含基因Lr34的最多，含Lr46或Sr2的次之，含Lr67的極少，同時(shí)含2個(gè)以上多效抗病基因的小麥品種仍較少。

中國(guó)小麥品種中多效抗病基因分布頻率較低，可能原因有3個(gè)：一是對(duì)多效抗病基因的重視不夠，一般僅作為成株抗病基因針對(duì)一種病害進(jìn)行選擇，而忽略了其多效性；二是多效抗病基因單個(gè)基因的抗性表現(xiàn)不佳，中國(guó)小麥育種當(dāng)前還是以常規(guī)育種為主，選育過(guò)程中追求高抗，多效抗病基因容易丟失；三是還未對(duì)多效抗病基因聚合后的效應(yīng)開(kāi)展系統(tǒng)研究，不同基因數(shù)量和組合對(duì)小麥抗病性、農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的影響尚不明確，影響了育種利用。

6 研究展望

近年來(lái)，全生育期抗性品種因病原生理小種變化喪失抗性頻繁發(fā)生，CIMMYT對(duì)成株抗性的系統(tǒng)研究和育種實(shí)踐表明聚合4～5個(gè)微效成株抗性基因可以培育出持久抗性品種，有效減少產(chǎn)量損失。通過(guò)聚合Lr34、Lr46和Lr67等若干基因，獲得兼抗型持久抗性是CIMMYT小麥抗病育種的主要策略，美國(guó)、澳大利亞和歐洲也正在開(kāi)展成株抗性研究或生產(chǎn)應(yīng)用[60]。CIMMYT和歐美對(duì)多效抗病基因利用的成功為中國(guó)小麥抗病育種指明了的方向。20世紀(jì)80年代以來(lái)，中國(guó)的育種家開(kāi)始進(jìn)行小麥成株抗性鑒定，相繼發(fā)現(xiàn)了豫麥2號(hào)、小偃6號(hào)、豫麥47、百農(nóng)64和魯麥21等大面積推廣的成株抗性品種[60]。與國(guó)外相比，當(dāng)前中國(guó)的小麥成株抗性的研究和應(yīng)用尚處于起步階段。四川省農(nóng)科院與CIMMYT合作開(kāi)展小麥育種始于2000年，2012年育成了96份成株抗性春小麥品系[58]。陽(yáng) 霞等[61]將RL6077攜帶的多效抗病基因?qū)胛鬓r(nóng)979，分析了其與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)性，獲得了抗病新種質(zhì)。中國(guó)農(nóng)科院作物所何中虎研究員多次在會(huì)議上強(qiáng)調(diào)多效抗病基因的重要性，并借鑒CIMMYT成熟的成株抗性育種方法，開(kāi)展了抗條銹病和抗白粉病育種嘗試，提出了兼抗型成株抗性育種方法，為多效抗病基因的育種利用提供了參考。含有多效抗病基因的小麥種質(zhì)材料被引入中國(guó)多年，但聚合2個(gè)以上多效抗病基因的小麥品種并不多。對(duì)成株抗性的深入研究，特別是Lr34基因功能的深入研究，改變了育種家對(duì)多效抗病基因的認(rèn)識(shí)，功能分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)為分子標(biāo)記輔助選擇育種掃清了障礙。在中國(guó)小麥品種(品系)中已發(fā)現(xiàn)基因Sr2、Lr34和Lr46，應(yīng)通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行選擇，并與其他抗病基因組合利用?；騆r67在中國(guó)利用較少，與受體親本Thatcher相比，含有Lr67的回交品系RL6077葉銹抗性明顯改善，且產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀均無(wú)明顯差異，表明其對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)性狀沒(méi)有負(fù)效應(yīng)，在育種上的應(yīng)用值得期待，應(yīng)加強(qiáng)該基因在中國(guó)小麥育種中的利用。有效利用已有的多效抗病基因，鑒定和克隆新基因，將會(huì)為中國(guó)選育兼抗型持久抗性小麥品種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。