冷雪峰 梅建東 劉倫旭

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的首要原因，中國每年新診斷的肺癌患者總數(shù)占全球的三分之一[1,2]，已成為全球最重要的公共健康問題之一。針對驅動基因表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）已成為一線治療方案[3]。但常在治療后的9個月-12個月，患者不可避免地出現(xiàn)耐藥。這也是導致EGFR突變肺腺癌治療失敗和預后不良的主要原因。肺腺癌EGFR-TKIs耐藥的發(fā)生是一個極為復雜的多因素、多途徑、多層次的過程，目前的研究尚未達成共識。研究表明，約60%EGFR突變肺腺癌發(fā)生T790M二次突變可能是EGFR-TKIs耐藥的主要機制[4]。另外，c-Met擴增、AXL激活、EMT激活以及IGF-1R信號通路的上調等也與EGFR-TKIs耐藥性的產生密切相關[4]。雖然基于分子靶向藥物等多模式的治療極大改善了NSCLC患者的臨床預后，但長期生存時間仍偏低，且復發(fā)和轉移率高[5]，促使人們開始關注免疫治療帶來的潛在獲益。程序性死亡受體-1（programmed death receptor 1,PD-1）/程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1,PD-L1）抗體為EGFR突變或EGFR-TKIs耐藥肺腺癌患者帶來了治療的曙光，但是目前在臨床上進行免疫干預的認識及選擇還是比較有限。因此，更好地理解EGFR-TKIs治療后調控免疫應答的分子事件成為一個緊迫的主題。為此，本文對不同信號通路參與調控EGFR突變肺腺癌PD-L1表達的相關研究進行綜述。

1 PD-L1

1.1 PD-L1的結構及分布 PD-L1也稱為B7-H1（B7 Homolog 1）或CD274（cluster of differentiation 274），是PD-1的共抑制性配體。PD-L1由PDCDL1基因編碼，位于染色體9p24.1。PD-L1被認為是B7蛋白家族的第三個成員，與B7.1和B7.2蛋白有15%-20%的同源性，1999年由Dong等首次將其命名為B7-H1。PD-L1的全長包括7個外顯子編碼區(qū)，對應一個含有290個氨基酸40 kDa長度的蛋白質。PD-L1是由胞外區(qū)IgV樣和IgC樣結構域，一個疏水跨膜結構域，以及30個氨基酸構成的一個短胞質尾區(qū)組成的I型跨膜蛋白，但其信號傳導作用仍不是很清楚[6,7]。PD-L1可表達于造血細胞，包括T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）和肥大細胞中。也可表達于非造血的健康組織細胞中，包括血管內皮細胞、角化細胞、胰島細胞、星形膠質細胞、胎盤滋養(yǎng)細胞、角膜上皮和角膜內皮細胞。同時，PD-L1還可在腫瘤細胞和腫瘤間質中表達。

1.2 PD-L1的生物學功能 PD-L1通過結合PD-1受體形成的PD-1/PD-L1通路在維持中樞和外周免疫耐受方面起到重要作用[8]。PD-L1在胸腺和樹突狀細胞中高表達，相互作用的PD-L1/PD-1會阻止幼稚T細胞的增殖和分化[9]，PD-L1還和CD80相互作用，從而對激活的T細胞產生負性調節(jié)作用[10]。其次，PD-1/PD-L1還參與免疫耗竭的生理機制，即在抗原持續(xù)存在的情況下誘導效應T細胞凋亡，抑制T細胞復制和成熟，以防止在慢性感染中出現(xiàn)組織破壞[11]。同時，PD-L1參與抗腫瘤免疫反應的調節(jié)，在腫瘤浸潤淋巴細胞中普遍發(fā)現(xiàn)PD-1持續(xù)性上調，而惡性腫瘤細胞會利用PD-L1的表達來逃避免疫系統(tǒng)對其造成破壞[12]。

2 EGFR突變調控肺腺癌PD-L1表達的相關信號通路

現(xiàn)認為，約20%-30% NSCLC中PD-L1的腫瘤比例分數(shù)（tumor proportion score,TPS）＞50%，其表達導致腫瘤免疫微環(huán)境改變，促進腫瘤細胞更具侵襲性和免疫逃逸[13]。亞洲人群EGFR突變率（47%）較非亞洲人群（13%-15%）更常見，主要為19外顯子缺失（del746_A750）或21外顯子點突變（L858R）[14,15]。目前，EGFR突變與PD-L1表達調控尚存在爭議，但是體外實驗及大中心研究均提示EGFR突變導致NSCLC中PD-L1表達異常升高。2014年，Azuma等[13]在Annals of Oncology發(fā)表研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達與EGFR突變關系密切且與影響NSCLC患者生存預后，且PD-L1 TPS≥50%與EGFR突變的相關性已在多項研究[16-18]中得以證實。但近期也有研究[19]顯示PD-L1在EGFR野生型肺癌組織中高表達，其表達與EGFR突變并無顯著相關性。從藥物治療造成癌細胞最初損傷到其最終死亡之間存在著多條信號傳導通路組成的網(wǎng)絡式調控體系[20]。因此，EGFR作為NSCLC重要致癌基因和藥物靶點，更好地理解EGFR突變通過不同相關信號通路直接或間接調控PD-L1表達參與腫瘤免疫逃逸尤為重要。

2.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路 NSCLC中EGFR可以激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，它能增加細胞增殖、代謝和存活能力，并在肺癌形成過程中起到關鍵作用。EGFR突變的NSCLC細胞中，當PI3K、AKT和mTOR表達同時下調，PD-L1的表達隨時間出現(xiàn)顯著下降[21,22]。在EGFR突變敏感細胞中使用EGFR-TKIs也會導致PD-L1表達下降。EGFR-TKIs不僅使EGFR磷酸化減弱，同時也降低AKT的磷酸化，從而進一步調節(jié)PD-L1的表達。下調PI3K表達后，AKT也出現(xiàn)磷酸化水平降低并最終導致PD-L1表達下降[17,21,23]。AKT/mTOR信號通路可在EGFR突變的肺腺癌中激活，且mTOR可獨立調節(jié)PD-L1的表達[22]。此外，γ-干擾素（interferon-gamma,IFN-γ）不僅起到重要的抗腫瘤作用，同時也可激活PI3K-AKT和JAK2-STAT1通路，抑制PI3K后不僅可下調PD-L1表達，同時可增強IFN-γ抗腫瘤增殖的能力，說明PI3K-AKT和JAK2-STAT1通路間存在一定交叉效應[24]。說明了PI3K/AKT/mTOR信號通路在EGFR突變NSCLC中對PD-L1的表達起到調節(jié)作用。但也有研究[25]顯示EGFR突變后AKT磷酸化激活，且抑制AKT磷酸化后并未出現(xiàn)PD-L1表達的變化，但其可能機制仍不明確。

2.2 MAPK信號通路 MAPK中的MEK/ERK通路通常由腫瘤異常上游信號酪氨酸激酶受體擴增或突變而激活。有證據(jù)表明MEK/ERK通過炎癥信號通路交叉調節(jié)PD-L1的表達[26]。在EGFR突變NSCLC細胞中也發(fā)現(xiàn)MEK-ERK信號通路對PD-L1表達起到調控作用[23,27]，激活ERK1/2通路可顯著上調PD-L1的表達[25]。但在一些研究中發(fā)現(xiàn)EGFR突變細胞中抑制ERK并未出現(xiàn)MAPK信號通路對PD-L1表達的調控現(xiàn)象[21]。即使在多個肺癌細胞系，包括EGF誘導PD-L1過表達細胞株中，使用MEK抑制劑也未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達發(fā)生變化[17,22]。說明MAPK信號通路并不是直接調控EGFR突變NSCLC的直接通路。

2.3 JAK/STAT信號通路 JAK/STAT是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和形成的一個經(jīng)典信號通路。無論在EGFR突變TIKs敏感/耐藥細胞株中，抑制JAK/STAT3后均出現(xiàn)PD-L1表達下降[21]。但使用EGFR-TKIs調節(jié)PD-L1表達時，只有使STAT3去磷酸化才會出現(xiàn)PD-L1表達下降，而直接沉默STAT3后并未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達的變化[23]。在EGF誘導的EGFR和STAT3磷酸化和激活細胞中，分別抑制和沉默STAT3和JAK2，PD-L1無論在mRNA水平還是蛋白水平均出現(xiàn)了顯著下降，提示JAK/STAT3通路在其中起到了重要作用[17,28]。

2.4 NF-κB信號通路 NF-κB作為轉錄因子家族，可在腫瘤突變癌基因和炎癥微環(huán)境產生的細胞因子下被激活。研究[29]發(fā)現(xiàn)NF-κB的亞基RELA（p65）可以在NSCLC細胞中結合PD-L1的啟動子，并以RELA-MUC1-C復合體的形式直接調控PD-L1的轉錄。NF-κB作為EGFR激活的重要下游通路，調節(jié)腫瘤細胞的增殖和化療耐藥。在EGFR突變細胞系中表達高于EGFR野生型，且與PD-L1表達呈正相關。當在EGFR突變細胞系中沉默NF-κB后，發(fā)現(xiàn)隨著NF-κB的亞基RELA（p65）的沉默，PD-L1的表達隨之衰減，再次證明EGFR突變NSCLC中PD-L1表達的升高需要NF-κB的參與[30]。

2.5 其他調控機制 Yes相關蛋白1（Yes associated protein 1,YAP）是Hippo通路上的效應因子，是許多癌癥中的致癌基因。作為共轉錄因子會和TEAD形成一個復合物，其具備DNA結合域并調節(jié)多個基因在細胞增殖、凋亡抑制、上皮間質轉化和其他方面的功能[31]。雖然YAP可能不會調節(jié)PD-L1的上游通路，但研究表明YAP可直接結合在PD-L1啟動子上從而調節(jié)其表達。在EGFR突變細胞株過表達YAP可增加PD-L1的表達，敲減YAP后PD-L1表達下降，而過表達PD-L1則對YAP的表達沒有影響。通過染色質免疫共沉淀技術（ChIP）發(fā)現(xiàn)YAP/TEAD結合在PD-L1啟動子區(qū)域，因此YAP是通過增加PD-L1的轉錄來調節(jié)其表達[32]。同時，YAP表達參與乏氧環(huán)境中的腫瘤進展[33]，在EGFR突變NSCLC中通過凋亡通路影響PD-L1調節(jié)EGFRTKI的耐藥[34]。

橋接整合因子-1（bridging integrator-1,BIN1）是一種MYC適配體蛋白，具有抑癌特性[35]。BIN1在NSCLC的EGFR突變細胞株中表達降低或缺失，而PD-L1在BIN1過表達后明顯下降，敲低BIN1后PD-L1表達明顯上調。無論體外還是體內實驗均證實BIN1的過表達可使EGFR/MAPK信號通路失活從而抑制和調控PD-L1介導的免疫逃逸[36]。

3 PD-1/PD-L1抑制劑在EGFR突變NSCLC中的應用

如前所述，EGFR突變可能通過不同信號通路影響PD-L1表達。EGFR突變NSCLC患者中EGFR-TKI獲得性耐藥也會導致PD-L1表達的明顯升高[37]，在經(jīng)過EGFR-TKI治療的患者中，獲得性MET陽性表達也參與了PD-L1表達升高的調控，在肺癌細胞中可能是通過miR-200/ZEB1進行調控[38]。那么PD-L1是否可以作為一個重要的EGFR突變NSCLC中免疫原性評價指標，繼而指導這類患者可能從免疫檢查點抑制劑或聯(lián)合EGFR-TKI治療中獲益。過往針對免疫檢查點抑制劑的臨床研究納入標準僅考慮PD-L1陽性一方面，隨著對EGFR突變調控PD-L1表達相關分子機制的不斷認識，針對EGFR突變患者抗PD-L1藥物療效的臨床數(shù)據(jù)也在不斷增多。Keynote-001作為I期臨床試驗發(fā)現(xiàn)EGFR突變NSCLC中使用pembrolizumab治療PD-L1陽性（TPS≥50%）和（TPS 1%-49%）患者的客觀緩解率（overall response rate,ORR）分別為20%和8.7%，而在PD-L1陰性（TPS＜1%）的情況下，ORR為0%[39]。在單臂、開放標簽II期涉及亞洲、歐洲和北美多中心臨床研究ATLANTIC中，應用durvalumab治療EGFR突變陽性、PD-L1高表達（TPS＞25%）的晚期或治療進展的NSCLC患者中，ORR為14.1%，明顯高于PD-L1低表達（TPS＜25%）的3.6%[40]。由于缺乏針對pembrolizumab在EGFR突變和非突變NSCLC患者中的臨床療效證據(jù)，一項II期臨床試驗（NCT02879994）對EGFR突變陽性且沒有接受過EGFR-TKI、晚期NSCLC及PD-L1陽性（＞1%，22C3抗體）的患者給予pembrolizumab治療。非常遺憾，由于缺乏治療有效性，該試驗入組11例患者后即終止。結果表明pembrolizumab在未接受TKI治療、PD-L1陽性（包括TPS＞50%）的EGFR突變陽性晚期NSCLC患者中并不適用[41]。

在聯(lián)合用藥方面，Checkmate-012研究評估了nivolumab聯(lián)合化療/erlotinib/ipilimumab或作為單藥治療NSCLC患者的安全性和耐受性。作為該研究的一部分，在nivolumab聯(lián)合erlotinib治療組中，入組21例患者經(jīng)過聯(lián)合用藥直到出現(xiàn)疾病進展或無法耐受的毒性反應，其ORR為19%，24周的無進展生存（progressive free survival,PFS）率為51%，18個月OS率為64%。其中20例EGFR-TKI經(jīng)治患者中3例達到部分緩解（partial response,PR），且中位緩解時間為60.1個月，1例EGFR-TKI初治的患者達到PR并在文獻報道時已持續(xù)接受了72.3個月的治療[42]。在多臂、開放標簽的Ib期TATTON試驗中，對Osimertinib聯(lián)合durvalumab治療EGFR-TKI敏感突變患者的效果進行評估。其中Osimertinib是一個強效、不可逆的EGFR-TKI藥物，主要作用于EGFR-TKI敏感突變和T790M突變引起的繼發(fā)耐藥。在23例EGFR-TKI經(jīng)治患者中，T790M突變陽性的ORR為67%，EGFR初治患者ORR達到70%，但由于治療期間肺間質疾?。╥nterstitial lung disease,ILD）的高發(fā)生率（13/34,38%），后續(xù)試驗入組已經(jīng)暫停[43]。另外，還有很多聯(lián)合治療的相關臨床試驗還在入組中，如NCT02039674、NCT02088112、NCT1454102、NCT02574078等。

4 展望

綜上所述，改善中晚期NSCLC患者生存問題一直是胸部腫瘤領域亟待解決的難題。EGFR突變可激活NSCLC細胞中的不同信號通路，介導PD-L1表達升高，從而導致免疫逃逸和治療失敗。但關于EGFR突變與PD-L1表達的相關研究仍處于起步階段，諸多未知因素尚有待解決。相信隨著對相關研究的不斷深入，將為PD-1/PD-L1抑制劑在EGFR突變NSCLC患者中單藥或聯(lián)合EGFR-TKIs的多模態(tài)免疫-靶向治療策略中提供理論基礎，以期改善未來NSCLC的治療預后。