趙多艷,衛(wèi)延安(南京理工大學(xué) 化工學(xué)院，南京 210094)

長循環(huán)脂質(zhì)體又稱空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(sterically stabilized liposomes, SSL)，具有增加靶向性、延長藥物在血液循環(huán)中的半衰期、提高其體內(nèi)穩(wěn)定性、改變脂質(zhì)體在體內(nèi)的生物學(xué)分布、隱性等優(yōu)點(diǎn)[1]，廣泛用作抗癌、抗菌、抗寄生蟲、抗病毒等的藥物載體。SSL是通過在脂質(zhì)體的成分中加入一定比例的糖脂(如單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GM1)或在磷酸分子上連接含多羥基基團(tuán)的物質(zhì)(如聚乙二醇PEG)，使脂質(zhì)體表面暴露出一些親水性的多糖或多羥基基團(tuán)等方式，減少與血漿中調(diào)理成分的結(jié)合，從而使脂質(zhì)體穩(wěn)定[2]。由于GM1難以大量提取或合成，且價(jià)格比較昂貴，目前應(yīng)用最廣泛的是PEG化脂質(zhì)體。

磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇作為藥物輔料在靶向藥物輸送和藥物緩釋等方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值，是常用的脂質(zhì)體空間穩(wěn)定膜材料，然而其昂貴的價(jià)格，在一定程度上制約了SSL的研究及應(yīng)用[3-4]，所以尋找一種合適的替代品很有必要。

大豆磷脂是加工大豆油的一種副產(chǎn)物，主要由大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)和大豆磷脂酰膽堿(SPC)組成，其中SPE中存在較多的不飽和脂肪酸，具有軟化血管、降低血壓和膽固醇的功能[5-7]。用SPE作為合成磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的磷脂來源，能夠顯著降低成本，具有一定的開發(fā)前景。本文以大豆磷脂和聚乙二醇單甲醚2000(MPEG2000)為原料制備了改性大豆磷脂——大豆磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇單甲醚2000(SPE-MPEG2000)，并對用其制備的SSL進(jìn)行了體外穩(wěn)定性評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

聚乙二醇單甲醚2000：海安石油化工廠；大豆磷脂(工業(yè)級；PC含量約21.2%，PE含量約19.8%，PI含量約16.2%，PA含量約6.9%)：廣州倚德磷脂科技有限公司；氫化大豆磷脂(HSPC，PC含量約95%)、膽固醇(Chol，95%)：南京都萊生物技術(shù)有限公司；鈣黃綠素(98%，色譜純)：無錫中坤生化科技有限公司；葡聚糖凝膠G-50：上海源葉生物科技有限公司；二次蒸餾水：實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE(III)500MHz型核磁共振儀：瑞士 Bruker； Nicolet iS10 FTIR型紅外光譜儀、EVOLUTION220型紫外可見分光光度計(jì)：美國賽默飛世爾科技公司；Tecnai 12型透射電子顯微鏡：美國FEI；ZS90型納米粒度及Zeta電位儀：英國Malvern；FL3-Tcspc型熒光光譜儀：法國HoribaJobinYvon；UP-250手?jǐn)y式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；透析袋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SPE-MPEG2000的制備

以MPEG2000為原料，采用瓊斯試劑氧化法室溫下制備聚乙二醇單甲醚2000羧基衍生物(CMPEG2000)，然后以CMPEG2000為原料，制備高活性的聚乙二醇單甲醚2000酰氯，最后以聚乙二醇單甲醚2000酰氯為原料與經(jīng)丙酮脫油處理后的大豆磷脂反應(yīng)制備SPE-MPEG2000，具體制備過程參照文獻(xiàn)[3]。將產(chǎn)物置于透析袋中透析1周以除去未反應(yīng)的MPEG2000[8-10]，然后凍干，備用。

1.2.2 SPE-MPEG2000的鑒定

分別采用核磁共振波譜法和紅外光譜法對SPE-MPEG2000進(jìn)行鑒定。

核磁共振波譜法檢測條件：氫核共振頻率500 MHz；5 mm PABBO BB的儀器探頭；溶劑為DMSO；內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為TMS；脈沖序列為Lclpncwps；弛豫時(shí)間為3.00 s；采樣次數(shù)為16次。

紅外光譜法：溴化鉀壓片。

1.2.3 脂質(zhì)體的制備

以薄膜分散法[11]制備普通脂質(zhì)體CLs(組成為HSPC-Chol，二者摩爾比為2∶1)和含有SPE-MPEG2000的SSL(組成為HSPC-Chol-SPE-MPEG2000，摩爾比為2∶1∶0.2)。分別取一定量的脂質(zhì)材料溶于適量氯仿，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去氯仿，得到脂質(zhì)薄膜，于真空干燥箱中放置一段時(shí)間，待有機(jī)溶劑揮干后，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.4)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)水化，然后置于水浴中超聲使之形成脂質(zhì)體懸液。將上述脂質(zhì)體懸液進(jìn)行探頭超聲6 min，進(jìn)一步勻化脂質(zhì)體粒徑，3 500 r/min離心10 min后，棄去少量沉淀，過0.22 μm濾膜3次，得脂質(zhì)體CLs和SSL。

1.2.4 脂質(zhì)體的形態(tài)觀察

分別吸取等量且適量的兩種樣品并以PBS緩沖液稀釋相同倍數(shù)后(下同)，滴于電鏡銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)自然晾干后，使用磷鎢酸負(fù)染，待干燥后，使用透射電子顯微鏡觀察并拍照。4℃放置30 d后再次測定。

1.2.5 脂質(zhì)體粒徑及Zeta電位的測定

CLs和SSL于制備后立即測定其平均粒徑、粒度分布、多分散系數(shù)以及Zeta電位，4℃放置30 d后再次測定。測試條件：測試溫度為25℃；分散介質(zhì)為蒸餾水。

1.2.6 乙醇對脂質(zhì)體吸光度的影響

取等量且適量稀釋后的CLs和SSL，分別加入一定量的無水乙醇，混合均勻，使溶液中乙醇含量分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%，室溫放置 1 h 后于400 nm處測定吸光度[12]。

1.2.7 鈣黃綠素脂質(zhì)體的制備及包封率的測定

1.2.7.1 鈣黃綠素脂質(zhì)體的制備

鈣黃綠素溶液的配制參照文獻(xiàn)[13]。將CLs和SSL用50 mmol/L的鈣黃綠素溶液(PBS，pH 7.4)水化，包封鈣黃綠素，分別制得鈣黃綠素脂質(zhì)體1和鈣黃綠素脂質(zhì)體2，計(jì)算包封率。

1.2.7.2 包封率的測定

配制質(zhì)量濃度依次為1.0、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L的鈣黃綠素溶液，在484 nm處分別測定其吸光度，以吸光度(Y)對質(zhì)量濃度(X)作線性回歸，得回歸方程為Y=0.094 4X+0.036 4，R2=0.999 4。

移取鈣黃綠素脂質(zhì)體0.1 mL過葡聚糖凝膠G-50 柱分離(以PBS緩沖液為洗脫劑)，收集脂質(zhì)體洗脫液，加入10% Triton X-100破壞脂質(zhì)體并定容，在484 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算脂質(zhì)體懸液包封的鈣黃綠素質(zhì)量濃度(C1)。另取鈣黃綠素脂質(zhì)體0.1 mL直接加入10% Triton X-100 破壞并定容后測定脂質(zhì)體中鈣黃綠素的總質(zhì)量濃度(C0)。包封率=C1/C0×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE-MPEG2000結(jié)構(gòu)分析

圖1 SPE-MPEG2000的1H NMR譜圖

圖2為原料及產(chǎn)物的紅外譜圖。由圖2可知，c中1 616 cm-1為伯氨基的剪式振動，b中1 649、1 532 cm-1分別為形成的酰胺鍵的羰基峰及仲酰胺的氨基峰，a和b中1 100 cm-1處為聚乙二醇C—O—C結(jié)構(gòu)的伸縮振動峰，由b中出現(xiàn)C—O—C結(jié)構(gòu)和腦磷脂上的羰基峰，同時(shí)1 616 cm-1處吸收峰的消失，可以判斷產(chǎn)物的生成。

注：a.CMPEG2000；b.SPE-MPEG2000；c.大豆磷脂。

圖2原料及產(chǎn)物的紅外譜圖

2.2 脂質(zhì)體的形態(tài)(見圖3)

注：a、b為初始制備的CLs；c、d為初始制備的SSL；e為4℃放置30 d后的CLs；f為4℃放置30 d后的SSL。

圖3CLs及SSL的透射電鏡圖

由圖3可知，制備所得CLs、SSL粒子都呈類球形且為空心結(jié)構(gòu)。通過對比可知SSL顆粒較為完整，粒徑較均勻，分散性好，粒徑小于200 nm，脂質(zhì)體膜相對略厚一些。4℃放置30 d后，觀察發(fā)現(xiàn)CLs出現(xiàn)結(jié)晶，而SSL中無結(jié)晶，這可能是由于CLs在放置過程中發(fā)生了泄漏。

2.3 脂質(zhì)體粒徑分布及Zeta電位

所得初始CLs和SSL均為乳白色均一、無沉淀的懸液，兩種脂質(zhì)體粒徑分布較為集中且呈單峰正態(tài)分布。初始及4℃放置30 d后脂質(zhì)體的粒徑及Zeta電位見表1。由表1可知，CLs的平均粒徑為(196.4±2.1)nm，多分散系數(shù)為0.216±0.003；SSL的平均粒徑為(178.3±1.8)nm，多分散系數(shù)為0.199±0.002，顆粒大小基本上與透射電鏡圖吻合。含SPE-MPEG2000的SSL粒徑略小，這是由于SPE-MPEG2000具有較強(qiáng)的乳化能力，在同樣的工藝條件下，磷脂等物質(zhì)更容易分散在水中形成脂質(zhì)體，使粒徑減小，這有利于增強(qiáng)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

Zeta電位測定結(jié)果表明，兩種脂質(zhì)體表面均呈荷電狀態(tài)，且SSL的Zeta電位絕對值低于CLs。因SPE-MPEG2000是一種非離子型親水性表面活性劑，當(dāng)脂質(zhì)體中加入SPE-MPEG2000后，SPE-MPEG2000可物理吸附于脂質(zhì)雙層表面，其聚氧乙烯基從脂質(zhì)雙層中伸出，覆蓋在雙層表面，形成具有一定厚度的立體位阻層[14-15]，但是過多的加入會造成脂質(zhì)體的泄漏，使脂質(zhì)體變得不穩(wěn)定[16]，因此SSL的Zeta電位測定值受SPE-MPEG2000的添加量所影響[17]。

4℃放置30 d后，兩種脂質(zhì)體的粒徑均增大，CLs的平均粒徑為(269.4±1.9)nm，比初始的CLs增大了37.17%，SSL的平均粒徑為(197.7±2.0)nm，比初始的SSL增大了10.88%，可知CLs粒徑增大幅度較SSL大得多。此外，CLs溶液中有少量白色絮狀沉淀物出現(xiàn)，與電鏡觀察結(jié)果相一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含SPE-MPEG2000的SSL穩(wěn)定性要優(yōu)于CLs。

表1 初始及4℃放置30 d后脂質(zhì)體的粒徑分布及Zeta電位

2.4 乙醇對脂質(zhì)體吸光度的影響(見圖4)

圖4 乙醇含量對兩種脂質(zhì)體吸光度的影響

由圖4可知，在加入一定比例的乙醇后，SSL的吸光度隨乙醇含量的增大基本保持不變，當(dāng)所加乙醇含量超過25%時(shí)，SSL的吸光度開始明顯減??；CLs的吸光度隨乙醇含量的增大呈現(xiàn)出不規(guī)律的波動變化。這可能是由于MPEG2000具有水溶性和高柔順性，可在脂質(zhì)體表面形成一層水化膜[18]，起到保護(hù)SSL脂質(zhì)體膜的作用，故其表現(xiàn)為抗乙醇溶蝕能力較強(qiáng)；而CLs表面無此水化膜，因此乙醇的加入對其吸光度影響較大，因此脂質(zhì)體SSL的穩(wěn)定性要優(yōu)于CLs。

2.5 脂質(zhì)體對鈣黃綠素的包封效果

按照1.2.7制備2種鈣黃綠素脂質(zhì)體，經(jīng)計(jì)算鈣黃綠素脂質(zhì)體1的平均包封率為4.78%(n=3)，鈣黃綠素脂質(zhì)體2的平均包封率為8.23%(n=3)，鈣黃綠素脂質(zhì)體2的包封率高于鈣黃綠素脂質(zhì)體1(P<0.05)，說明含SPE-MPEG2000 SSL的穩(wěn)定性高于CLs。

3 結(jié) 論

(1)以大豆磷脂和MPEG2000為原料制備改性大豆磷脂，方法簡易、條件溫和，且在一定程度上解決了磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇生產(chǎn)成本高的問題，具有較好的應(yīng)用前景。

(2)脂質(zhì)體粒徑大小和分布均勻程度與其包封率和穩(wěn)定性有關(guān)，直接影響脂質(zhì)體在機(jī)體組織的行為和處置。通過實(shí)驗(yàn)可知，適量改性大豆磷脂的加入可以改善普通脂質(zhì)體的粒徑分布，提高顆粒的完整度及包封率，增強(qiáng)其放置穩(wěn)定性及膜穩(wěn)定性，因此改性大豆磷脂對脂質(zhì)體有良好的穩(wěn)定作用，符合脂質(zhì)體空間穩(wěn)定膜材料的要求。故以大豆磷脂為原料合成磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇能夠拓寬脂質(zhì)體的研究范圍且具有一定的意義。

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