聶斌英，劉紅民 (宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

乙醇被廣泛應(yīng)用于國民生活的各個(gè)方面：食品方面被用作各種酒的配制原料；化工方面是許多化工產(chǎn)品不可缺少的基礎(chǔ)原料和溶劑；醫(yī)藥和醫(yī)療方面可用于提取、配制各種醫(yī)藥制劑和消毒液。近年來，由于石油等能源的大量消耗以及工業(yè)的不斷發(fā)展導(dǎo)致對(duì)能源的需求日益增加，乙醇作為清潔、安全、環(huán)保的再生能源被用于燃料及石油添加劑。

傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)是以農(nóng)作物(大米、玉米、紅薯等)為原料。但隨著國家糧食價(jià)格的不斷放寬，乙醇發(fā)酵成本劇增。所以尋求廉價(jià)的、能取代農(nóng)作物發(fā)酵乙醇的原料成為當(dāng)務(wù)之急。

油茶籽粕中蛋白質(zhì)和糖類的含量在40%～50%。茶籽多糖主要由6種單糖組成，即木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖，蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)是生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的優(yōu)質(zhì)原料。油茶籽粕中的多糖類以及粗纖維能夠被微生物發(fā)酵生成還原糖，為油茶籽粕生物發(fā)酵生產(chǎn)生物能源乙醇提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。因此，如何有效地利用油茶籽粕中的多糖、纖維素與半纖維素轉(zhuǎn)換為還原糖，再進(jìn)一步發(fā)酵為乙醇，是油茶籽綜合開發(fā)利用研究的又一課題。

本文以油茶籽粕為原料，將其粉碎后經(jīng)酸-菌-酶綜合處理后將其中的木質(zhì)纖維、纖維素、半纖維等物質(zhì)轉(zhuǎn)換為還原糖，得到水解液。再用氫氧化鈣進(jìn)行澄清處理，去除糠醛等發(fā)酵抑制劑。向水解液中接種酵母[2]后通過單因素實(shí)驗(yàn)，控制酵母接種量、pH、氯化銨添加量、鈣鎂離子比的變化，28℃下發(fā)酵48 h，以乙醇得率為指標(biāo)確定各變量范圍，排除影響較小的因素pH，最后通過響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽粕，宜春青龍高科有限公司；黃孢原毛平革菌，廣東省微生物菌種保藏中心；酵母，安琪酵母股份有限公司；纖維素酶(100 000 U/g)，和氏璧生物科技有限公司。

無水乙醇、濃硫酸、重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化銨等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BS-223S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LRO數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；ZHWY-2102C恒溫?fù)u床，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；SW-CJ-ZD超凈工作臺(tái)，蘇州蘇杰凈化設(shè)備有限公司；LX-B35L高壓蒸汽滅菌鍋，上海三中醫(yī)療器材有限公司；UV-2800AH紫外可見分光光度計(jì)，上海天普分析儀器有限公司；SPX-250BS-II恒溫培養(yǎng)箱，上海新藥醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶籽粕酸-菌-酶預(yù)處理

油茶籽粕粉碎后，稱取20 g進(jìn)行酸處理：以1∶10 的固液比加入2%的硫酸溶液后在100℃下處理120 min。后將pH調(diào)到6.0，再經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后接種2%的黃孢原毛平革菌，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 d，溫度26℃，pH 6.0，轉(zhuǎn)速150 r/min。菌處理完之后，將樣品取出進(jìn)行滅菌，然后加入1%的纖維素酶，進(jìn)行酶處理，溫度50℃，pH 5.0，時(shí)間10 min[3]。

1.2.2 去除抑制劑

將樣品過濾后往濾液中加入2 g氫氧化鈣，與樣液快速充分?jǐn)嚢杌旌?，將pH調(diào)到10.0，靜置1 h后過濾，再用濃硫酸酸化將pH調(diào)到5.5，靜置1 d后再次過濾[4]。

1.2.3 發(fā)酵制備乙醇

調(diào)節(jié)水解液發(fā)酵初始pH，按一定的鈣鎂離子比添加氧化鈣和氯化鎂，添加一定量的氯化銨并接種酵母，于恒溫?fù)u床厭氧發(fā)酵3 d，溫度28℃，轉(zhuǎn)速130 r/min[5]。

1.2.4 分析方法

發(fā)酵前樣液中總還原糖及發(fā)酵后殘?zhí)峭ㄟ^DNS法測定。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于15 mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL，分別加入DNS試劑2.0 mL，沸水浴加熱2 min，流水冷卻，用蒸餾水補(bǔ)足到15 mL，在520 nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。再將樣品取1.0 mL于15 mL比色管中，與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液做同樣處理，在520 nm波長下測定吸光度，將吸光度代入回歸方程中，得到還原糖的含量[6]。

乙醇含量的測定通過重鉻酸鉀氧化分光光度法測定。分別取乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 mg/mL)0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL于10 mL比色管中，分別加入5.0%重鉻酸鉀溶液(5 g重鉻酸鉀溶于50 mL蒸餾水中，加入10 mL濃硫酸，加水至100 mL)2.0 mL，加水至10 mL，沸水浴加熱10 min，流水冷卻5 min，在600 nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。取1.0 mL樣品于10 mL比色管中，與乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液做同樣處理，在600 nm波長下測定吸光度，將吸光度代入回歸方程中，得到乙醇的含量[7]。

乙醇得率按下式計(jì)算。

式中：R1為乙醇得率，%；M為實(shí)驗(yàn)測得乙醇量，mg；T為總還原糖量，mg；C為殘?zhí)橇浚琺g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵初始pH對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵初始pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，鈣鎂離子比為1∶1，氯化銨添加量為0.75%，酵母接種量為0.4%條件下，考察發(fā)酵初始pH對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵初始pH對(duì)乙醇得率的影響

發(fā)酵初始pH對(duì)酵母的生長及發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力有一定的影響。酵母一般在弱酸條件下生長。當(dāng)發(fā)酵初始pH過低時(shí)，影響酵母細(xì)胞膜的帶電狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響酵母對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及代謝廢物的排放，從而影響細(xì)胞的生長代謝[8]。當(dāng)發(fā)酵初始pH過高時(shí)，增加了發(fā)酵液染菌的可能性。由圖1可知，隨著發(fā)酵初始pH的增加，乙醇得率先增后降，pH 5.0后乙醇得率的變化不明顯，因此可認(rèn)為發(fā)酵初始pH對(duì)乙醇得率的影響并不大。

2.1.2 鈣鎂離子比對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵初始pH為5.0，鈣鎂離子比分別為0.1∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，氯化銨添加量為0.75%，酵母接種量為0.4%條件下，考察鈣鎂離子比對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 鈣鎂離子比對(duì)乙醇得率的影響

在活細(xì)胞的生長代謝過程中，鈣離子和鎂離子都是重要金屬離子，鈣離子對(duì)細(xì)胞骨架有著重要的調(diào)控作用[8]。鎂離子可通過細(xì)胞分裂周期的影響間接影響酵母的生長代謝，同時(shí)鎂離子還參與多種物質(zhì)的變化，可促進(jìn)酵母的發(fā)酵能力[9]。目前，國內(nèi)外已有很多酒廠在酵母發(fā)酵過程中添加鈣鎂離子，以提高發(fā)酵效率。但是鈣離子的存在會(huì)對(duì)鎂離子有拮抗作用，從而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，因此在酵母發(fā)酵過程中，必須控制合適的鈣鎂離子比。由圖2可知，隨著鈣鎂離子比的增大，乙醇得率先增后降，鈣鎂離子比在1∶1時(shí)，乙醇得率最高。

2.1.3 氯化銨添加量對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵初始pH為5.0，鈣鎂離子比為1∶1，氯化銨添加量分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%，酵母接種量為0.4%條件下，考察氯化銨添加量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 氯化銨添加量對(duì)乙醇得率的影響

氮源是酵母合成核糖和蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)的重要原料，油茶籽粕中氮含量較低，適當(dāng)改善發(fā)酵液的營養(yǎng)成分，可以對(duì)酵母發(fā)酵起到促進(jìn)作用。氮源的添加可以是無機(jī)氮如銨鹽和尿素等，也可以是有機(jī)氮源如酸性蛋白酶[10]。 由圖3可知，在氯化銨添加量為0.25%～0.75%范圍內(nèi)，乙醇得率增加，在氯化銨添加量大于0.75%時(shí)，乙醇得率的變化不明顯。

2.1.4 酵母接種量對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵初始pH為5.0，鈣鎂離子比為1∶1，氯化銨添加量為0.75%，酵母接種量分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%條件下，考察酵母接種量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酵母接種量對(duì)乙醇得率的影響

酵母接種量對(duì)酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力有很大影響，當(dāng)酵母接種量過少時(shí)，導(dǎo)致發(fā)酵空間利用率不足，造成營養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)，發(fā)酵能力也不足，從而降低乙醇得率。酵母接種量過大時(shí)，空間不足，營養(yǎng)物質(zhì)也不足，從而酵母之間競爭空間和營養(yǎng)，產(chǎn)生競爭性抑制，也會(huì)降低乙醇得率。由圖4可知，隨著酵母接種量的增加，乙醇得率先增后降，在酵母接種量為0.4%時(shí)，乙醇得率最高。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇得率(R1)為響應(yīng)值，固定發(fā)酵初始pH 5.0，以鈣鎂離子比(X1)，氯化銨添加量(X2)，酵母接種量(X3)為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面因素水平編碼見表1，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

注：P<0.05高度顯著，P<0.1顯著。

對(duì)擬合方程進(jìn)行一階偏導(dǎo)，得出3個(gè)因素的極值點(diǎn)，分別為鈣鎂離子比0.87∶1、氯化銨添加量0.76%、酵母接種量0.40%；此時(shí)得到乙醇得率為95.4%。為了便于實(shí)驗(yàn)操作，將實(shí)驗(yàn)條件修正為鈣鎂離子比0.90∶1、氯化銨添加量0.75%、酵母接種量0.40%，在此條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，得到乙醇得率的平均值為94.3%，與預(yù)測值相對(duì)偏差為1.15%。

3 結(jié) 論

適度發(fā)展廢物再利用，是解決環(huán)境污染、能源浪費(fèi)、緩解能源危機(jī)的有效途徑。本文通過單因素實(shí)驗(yàn)確定鈣鎂離子比、氯化銨添加量、酵母接種量這3個(gè)主要影響因素的最適范圍，通過響應(yīng)面法，建立乙醇得率對(duì)鈣鎂離子比、氯化銨添加量、酵母接種量的回歸模型。確定了油茶籽粕中還原糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的最佳工藝條件為：發(fā)酵初始pH 5.0，鈣鎂離子比0.90∶1，氯化銨添加量0.75%，酵母接種量0.40%。在最佳工藝條件下，乙醇得率為94.3%。

[1] 朱培.油茶粕固態(tài)發(fā)酵及其蛋白質(zhì)水解物抗氧化的研究[D].長沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2012.

[2] 李秋園. 纖維素原料酶水解及酒精發(fā)酵的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2006.

[3] 曹衛(wèi)星.預(yù)處理方法對(duì)甜高粱莖稈汁液及殘?jiān)掖及l(fā)酵的影響[D].上海:上海交通大學(xué),2012.

[4] QEVEDO-HIDALGO B,MONSALVE-MARIN F, NARVEZ-RINCN P C,et al.Ethanol production bySaccharomycescerevisiaeusing lignocellulosic hydrolysate fromChrysanthemumwaste degradation[J].World J Microbiol Biotechnol,2013,29(3):459-466.

[5] DIEN B S ,COTTA M A ,JEFFRIES T W. Bacteria engineered for fuel ethanol production:current status[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63(3):258-266.

[6] 王俊剛,張樹珍,楊本鵬,等.3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定甘蔗莖節(jié)總糖和還原糖含量[J].甘蔗糖業(yè),2008(5):45-48.

[7] 林仁權(quán),胡文蘭,陳國亮.重鉻酸鉀氧化分光光度法測定酒中乙醇含量[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,18(3):78-79.

[8]王立安,趙俊霞.鈣對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)控及其在生命活動(dòng)中的重要作用[J].生物學(xué)雜志,1999,16(4):6-7.

[9] 趙春海，趙土豪.鈣鎂對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響[J].食品研究與開發(fā),2007,28(10):46-48.

[10] 岳瑞雪,孫鍵,鈕福祥,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化甘薯乙醇發(fā)酵條件[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2014,28(8):1400-1406.