宋春麗，任 健，陳佳鵬，康文娜，張 新 (齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

大豆分離蛋白(SPI)的蛋白質(zhì)含量可達90%以上，營養(yǎng)價值高，消化利用率也較高。大豆分離蛋白作為功能性配料添加于許多食品中，在食品工業(yè)中備受關(guān)注。但作為食品功能性配料的需求多種多樣，單一來源的天然蛋白質(zhì)，不可能具備所有期望的蛋白質(zhì)特性。因而，蛋白質(zhì)改性技術(shù)是一種獲得具有特定的功能性質(zhì)和營養(yǎng)特性的必要手段。

酶法水解蛋白質(zhì)是利用蛋白酶的催化作用，使蛋白質(zhì)肽鍵斷裂，得到蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[1]以及某些功能性質(zhì)，如改善燕麥濃縮蛋白的溶解性、乳化性[2]，乳清蛋白的生物活性[3]。與之不同的是，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)催化的糖基化作用，通過蛋白質(zhì)與氨基糖的交聯(lián)作用，將氨基糖導(dǎo)入到食品蛋白質(zhì)分子中[4]。該修飾作用能夠有效改善蛋白質(zhì)的一些功能性質(zhì)，如流變性、凝膠性及乳化穩(wěn)定性[5-7]。然而，限制性酶解對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化制備的糖基化蛋白質(zhì)的構(gòu)象及功能性質(zhì)的研究鮮有報道。

本研究通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化大豆蛋白(SPI)與殼寡糖發(fā)生糖基化交聯(lián)反應(yīng)，制備糖基化大豆蛋白(GSPI)，隨后利用胰蛋白酶酶解該蛋白質(zhì)。分析糖基化及蛋白酶的酶解作用對大豆蛋白的構(gòu)象及功能性質(zhì)的影響，為擴大大豆蛋白作為功能性食品配料的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脫脂豆粉：哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶：江蘇一鳴精細化工有限公司；殼寡糖(平均相對分子質(zhì)量為1 kDa，脫乙酰度≥90%)：浙江金殼生物化學(xué)有限公司；胰蛋白酶(酶活>2 500 U/mg)：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

RF-5301pc型熒光分光光度計：日本島津公司；UV5100型紫外可見分光光度計；CF15RX型高速離心機：Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基化大豆蛋白及其胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的制備

按照文獻[6]的方法制備糖基化大豆蛋白(GSPI)。將其分散液(3.5%，pH 7.0)于60℃下加入1%胰蛋白酶，反應(yīng)過程中通過滴加0.5 mol/L NaOH溶液維持體系pH(7.0)恒定。根據(jù)pH-Stat法[8]計算NaOH溶液的添加量，反應(yīng)結(jié)束后立即取出酶解液，85℃滅酶5 min。冷卻后，凍干備用，制得水解度(DH)分別為1%、5%、10%和15%的酶解產(chǎn)物。

1.2.2 內(nèi)源熒光發(fā)射光譜分析

將蛋白質(zhì)分散液(0.5 mg/mL，pH 7.0的10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液)在10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液。在發(fā)射波長為290 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm條件下，掃描300～500 nm的發(fā)射光譜。

1.2.3 熱穩(wěn)定性的測定

熱穩(wěn)定性=Cpo/Cpt×100%

式中：Cpo為上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；Cpt為大豆蛋白分散液的質(zhì)量濃度(1 mg/mL)。

1.2.4 起泡性的測定

參照Motoi等[11]的方法，采用攪打法測定大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.2.5 乳化性的測定

參照Pearce等[12]的方法，采用比濁法測定大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1.2.6 體外消化性的測定

參照Song等[13]的方法。采用兩步酶解法，即一步酶解(胃蛋白酶酶解)和兩步酶解(胃蛋白酶-胰蛋白酶酶解)模擬蛋白質(zhì)的消化，以消化液在三氯乙酸溶液中的可溶性氮含量表示蛋白質(zhì)的體外消化能力，以其在280 nm處吸光值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 三級結(jié)構(gòu)

大豆蛋白、糖基化大豆蛋白及其酶解產(chǎn)物的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜如圖1所示。

圖1 大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜

從圖1可以看出，大豆蛋白的熒光峰在336 nm處，是典型的色氨酸熒光光譜[14]，表明色氨酸基位于大豆蛋白的疏水性區(qū)域，如蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部。相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白及其酶解產(chǎn)物對應(yīng)的波長分別為347 nm和343～349 nm，高于大豆蛋白，表明發(fā)生了紅移。一般來說，最大吸收波長的紅移，表明熒光發(fā)射基團暴露在溶劑中，蛋白質(zhì)分子展開。熒光分析結(jié)果表明，酶解改性使蛋白質(zhì)的肽鏈伸展，并伴隨著更多包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團暴露于水溶液中[14]。即大豆蛋白修飾產(chǎn)物具有更加松散的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

2.2 熱穩(wěn)定性

糖基化大豆蛋白及其酶解產(chǎn)物在pH 4.0和pH 7.0的熱穩(wěn)定性變化如圖2所示。

圖2 大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性

從圖2可以看出，相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白經(jīng)過熱處理后，熱穩(wěn)定性下降。而其經(jīng)過胰蛋白酶酶解后，熱穩(wěn)定性顯著提高，pH 4.0和pH 7.0的酶解產(chǎn)物(DH 15%)經(jīng)過熱處理后，仍分別有50.74%和67.66%的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，胰蛋白酶的酶解顯著地增強了糖基化大豆蛋白的熱穩(wěn)定性。這是由于胰蛋白酶切斷了蛋白質(zhì)肽鏈中賴氨酸、精氨酸殘基中的羧基，增加的帶電氨基酸能夠形成更多的離子鍵，這對提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性起到了關(guān)鍵作用[15]。胰蛋白酶修飾產(chǎn)物在酸性及中性pH條件下均具有較好的熱穩(wěn)定性，這將擴大大豆蛋白在食品加工中作為配料的應(yīng)用范圍。

2.3 起泡性(見圖3)

從圖3可以看出，相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的起泡性沒有顯著變化，而其胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加先增加后下降，水解度為10%的酶解產(chǎn)物的起泡性最大(92.5%)，當(dāng)水解度繼續(xù)增加到15%時，酶解產(chǎn)物的起泡性反而下降。糖基化大豆蛋白具有較高的泡沫穩(wěn)定性，而其胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性下降，水解度為15%的糖基化大豆蛋白的泡沫穩(wěn)定性最低(51.3%)。這是因為酶解改性后蛋白質(zhì)的平均相對分子質(zhì)量降低，蛋白質(zhì)更容易在界面擴散，吸附在氣-液界面，所以起泡性增加。酶解導(dǎo)致大豆蛋白的黏度下降，電荷數(shù)目增加過多，使氣液薄膜強度降低，泡沫易破裂，泡沫穩(wěn)定性下降[16]。

圖3 大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的起泡性與泡沫穩(wěn)定性

2.4 乳化性(見圖4)

圖4 大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性

從圖4可以看出，相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的乳化活性下降，而其胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性隨著水解度的增加而增加，這表明糖基化大豆蛋白酶解產(chǎn)物更易于向水油界面擴散，排列更為有序[17]。糖基化大豆蛋白的乳化穩(wěn)定性提高，其酶解產(chǎn)物也表現(xiàn)出較高的乳化穩(wěn)定性，但當(dāng)水解度大于5%時，酶解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性下降，這是由于不同水解度的酶解產(chǎn)物中低相對分子質(zhì)量肽的含量不同。研究表明，胰蛋白酶酶解有利于提高大豆蛋白的乳化活性，但是酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量較低(10 kDa)時，酶解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性下降[18]。

2.5 體外消化性(見圖5)

圖5 大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的體外消化性

由圖5可以看出，一步酶解中(胃蛋白酶的消化作用)，糖基化大豆蛋白的體外消化能力低于大豆蛋白，而其胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的體外消化能力隨著水解度的增加逐漸增強，水解度為10%的酶解產(chǎn)物的體外消化能力與大豆蛋白的體外消化能力沒有顯著差異；兩步酶解(胃蛋白酶-胰蛋白酶酶解)顯著提高了糖基化大豆蛋白的體外消化能力。結(jié)果表明，大豆蛋白修飾產(chǎn)物對胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感性存在差異，體外消化能力不同。

3 結(jié) 論

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化及胰蛋白酶的酶解作用都可以賦予大豆蛋白疏松的三級結(jié)構(gòu)。糖基化作用提高了大豆蛋白的泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性。酶解作用能夠顯著提高大豆蛋白溶液在酸性及中性條件下的熱穩(wěn)定性；控制水解度能夠改善大豆蛋白的乳化性和起泡性。兩種修飾作用會改變大豆蛋白的體外消化能力。結(jié)合兩種修飾作用可以制備具有特定功能性質(zhì)的食品蛋白質(zhì)配料。

[1] 龐美蓉, 丁秀臻, 孔祥珍,等. 蛋白酶水解大豆分離蛋白的分子水平表征[J]. 中國油脂, 2013, 38(5):20-23.

[2] GUAN X, YAO H, CHEN Z, et al. Some functional properties of oat bran protein concentrate modified by trypsin[J]. Food Chem, 2007, 101(1): 163-170.

[3] FERREIRA I, PINHO O, MOTA M V, et al. Preparation of ingredients containing an ACE-inhibitory peptide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates[J]. Int Dairy J, 2007, 17(5): 481-487.

[4] KIELISZEK M, MISIEWICZ A. Microbial transglutaminase and its application in the food industry. A review [J]. Folia Microbiol, 2014, 59(3): 241-250.

[5] JIANG S J, ZHAO X H. Transglutaminase-induced cross-linking and glucosamine conjugation in soybean protein isolates and its impacts on some functional properties of the products [J]. Eur Food Res Technol, 2010, 231(5):679-689.

[6] SONG C L, ZHAO X H. Structure and property modification of an oligochitosan-glycosylated and crosslinked soybean protein generated by microbial transglutaminase[J]. Food Chem, 2014, 163(12): 114-119.

[7] FU M, ZHAO X H. Modified properties of a glycated and cross-linked soy protein isolate by transglutaminase and an oligochitosan of 5 kDa [J]. J Sci Food Agric, 2017, 97(1): 58-64.

[8] ADLER-NISSEN J. Limited enzymic degradation of proteins: a new approach in the industrial application of hydrolases[J]. J Chem Technol Biotechnol, 1982, 32:138-156.

[10] LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951, 193(1): 265-275.

[11] MOTOI H, FUKUDOME S, URABE I. Continuous production of wheat gluten peptide with foaming properties using immobilized enzymes [J]. Eur Food Res Technol, 2004, 219(5): 522-528.

[12] PEARCE K N, KINSELLA J E. Emulsifying properties of proteins: evaluation of a turbidimetric technique[J]. J Agric Food Chem, 1978, 26(3): 716-723.

[13] SONG C L, ZHAO X H. The preparation of an oligochitosan-glycosylated and cross-linked caseinate obtained by a microbial transglutaminase and its functional properties[J]. Int J Dairy Technol, 2014, 67(1):110-116.

[14] ZHAO G, LIU Y, ZHAO M, et al. Enzymatic hydrolysis and their effects on conformational and functional properties of peanut protein isolate[J]. Food Chem, 2011, 127(4): 1438-1443.

[15] 田健, 王平, 伍寧豐,等. 理性設(shè)計提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究進展[J]. 生物技術(shù)進展, 2012, 2(4):233-239.

[16] 黃群, 楊萬根, 金永國,等. 酶法改善卵白蛋白起泡性[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(23):171-175.

[17] 趙新淮, 侯瑤. 大豆蛋白限制性酶解對乳化性質(zhì)和吸油性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報, 2009, 40(12):159-163.

[18] 任方林，楊玥熹，陳業(yè)明，等.大豆乳清蛋白及其糖基化產(chǎn)物體外模擬胃腸消化特性研究[J].中國油脂, 2016, 41(9):18-23.