孔德榮 孫鶴 李慧 王智誠(chéng) 仇雪梅 劉海映 王秀利

摘 要：?? 為探討重組紅鰭東方鲀（ Takifugu rubripes ）干擾素γ（rIFNg-γ）對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答，以不同濃度（25 μg/mL rIFNg-γ為實(shí)驗(yàn)組1、50 μg/mL rIFNg-γ為實(shí)驗(yàn)組2）的原核表達(dá)的IFN-γ重組蛋白免疫6月齡健康紅鰭東方鲀，PBS作為對(duì)照組，于腹腔注射后6、12、24、36 h取腎臟組織。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腎組織IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因在腎臟組織不同時(shí)間表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀經(jīng)rIFNg-γ免疫后6～36 h，IFN-α基因在實(shí)驗(yàn)組1中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，24 h時(shí)表達(dá)量最高;在實(shí)驗(yàn)組2中的表達(dá)量在6 h最高，隨后呈下降趨勢(shì)。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6 h表達(dá)量都出現(xiàn)最大值且實(shí)驗(yàn)組1高于實(shí)驗(yàn)組2，隨后呈下降趨勢(shì)。Mx1基因的表達(dá)則出現(xiàn)上升趨勢(shì)，24 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后下降。

關(guān)鍵詞： 紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）;腎臟;重組干擾素γ;免疫相關(guān)基因;基因表達(dá)

我國(guó)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀（ Takifugu rubripes ）已有二十余年，人工繁殖、育苗、養(yǎng)成技術(shù)基本成熟。但隨著紅鰭東方鲀養(yǎng)殖規(guī)模及養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其是細(xì)菌性疾病、病毒性疾病等 ?[1] 流行范圍廣、發(fā)生頻繁、死亡率高，在一定程度上制約了紅鰭東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

利用本課題組前期構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)并小批量制備的重組紅鰭東方鲀IFN-γ，免疫紅鰭東方鲀，檢測(cè)免疫相關(guān)基因IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ（主要組織相容性復(fù)合體I基因（ Major histocompatibility complex classⅠ，MHCⅠ））、Mx1（黏病毒耐藥蛋白1）在腎組織的表達(dá)情況，為重組紅鰭東方鲀IFN-γ作為魚類免疫增強(qiáng)劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用紅鰭東方鲀購(gòu)自大連天正實(shí)業(yè)有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)，體重150±20 g，體長(zhǎng)16～18 cm，實(shí)驗(yàn)前于連續(xù)充氣的水槽中暫養(yǎng)2周，水溫15～18 ℃，每天投餌2次，其他按常規(guī)管理。暫養(yǎng)后，紅鰭東方鲀隨機(jī)分成3組，每組75尾，以PBS（pH=7.4） 緩沖液為溶劑，將原核表達(dá)的紅鰭東方鲀IFN-γ重組蛋白（rIFN-γ）制成終濃度分別為25 μg/mL、50 μg/mL的溶液。三組個(gè)體分別腹腔注射PBS緩沖液、25 μg/mL rIFNg-γ、50 μg/mL rIFNg-γ各200 μL，其中PBS組為陰性對(duì)照，25 μg/mL rIFNg-γ組為實(shí)驗(yàn)組1，50 μg/mL rIFNg-γ組為實(shí)驗(yàn)組2。處理后，分別于0、6、12、24、36 h取3個(gè)組紅鰭東方鲀腎臟組織。將采取的腎組織樣按照1：5（v/v） 比例放入RNA later中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

RNAiso plus試劑，Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物生物有限公司; DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程（上海）有限公司; ?TransStart ?Top Green qPCR Supermix 試劑盒等購(gòu)自北京全式金生物科技公司。Ambion RNAlater 購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，其他分析純藥品等均購(gòu)自大連辰鈺生物公司。

1.3 免疫基因及其引物設(shè)計(jì)

以紅鰭東方鲀?chǔ)?actin基因作為內(nèi)參基因，選取紅鰭東方鲀IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx等免疫基因，分析紅鰭東方鲀注射重組IFN-γ蛋白后這些免疫基因表達(dá)量的變化情況。利用Primer 5進(jìn)行內(nèi)參基因和免疫基因的引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好的引物由上海生物工程有限公司進(jìn)行合成（表1）。

1.4 總RNA的提取

將同一組織、同一實(shí)驗(yàn)組、相同時(shí)間點(diǎn)的樣品于液氮中混勻后充分研磨并分裝，-80 ℃保存，用于總RNA提取實(shí)驗(yàn)。參照RNAiso plus說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取。瓊脂糖凝膠電泳初步測(cè)定總RNA完整性，分光光度計(jì)及Aligent2000測(cè)定總RNA濃度及純度。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

選取OD 260 /OD 280 =1.8～2.0的RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物生物有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA第一鏈，具體反應(yīng)體系（表2）及反應(yīng)條件如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ?以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。按照5點(diǎn)10倍稀釋法將cDNA進(jìn)行稀釋用作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線法，利用全式金 TransStart ? Top Green qPCR SuperMix試劑盒在ABI Step One Plus上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：即模板1 μL，正反向引物各0.6 μL（引物濃度10 μm/L），buffer 10 μL，Dye 0.4 μL，Rnase Free dH2O 7.4 μL。每個(gè)樣品3次重復(fù)，反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s;94 ℃，5 s;60 ℃，30 s。觀察熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定Ct值。

1.6.2 相對(duì)定量PCR及數(shù)據(jù)處理 ?取上述cDNA為模板，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行相對(duì)定量PCR。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同1.6.1。采用2-△△Ct法計(jì)算同一基因在不同組織的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將數(shù)據(jù)輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)總RNA提取效果，結(jié)果如圖1所示，28 S、18 S條帶清晰且28 S條帶亮度約是18 S亮度的1～2倍。分光光度計(jì)測(cè)定組織總RNA OD 230nm 、 OD 260nm 、OD 280nm ，確定總RNA濃度（OD 260nm / OD 280nm =1.8～2.0） 及純度（OD 260nm / OD 230nm =1.5～2.0） 滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將總RNA轉(zhuǎn)變成cDNA第一鏈，瓊脂糖電泳檢測(cè)條帶呈彌散狀。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)定量PCR制作β-actin、IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，結(jié)果顯示5個(gè)基因的溶解曲線分別在88.27 ℃、85.13 ℃、87.82 ℃、82.25 ℃、83.54 ℃有單一峰且無(wú)雜峰，說(shuō)明引物均具有良好的特異性，如圖2所示，滿足實(shí)時(shí)定量PCR的要求。

觀察各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表模板相對(duì)濃度即稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值，反映了基因出現(xiàn)擴(kuò)增時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過(guò)調(diào)整cDNA的濃度，各基因擴(kuò)增效率均達(dá)到90%～110%，R 2均大于0.998，可以認(rèn)為各基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致，滿足相對(duì)定量PCR中2 ?-△△Ct 法原理及要求。

2.3 免疫基因的組織表達(dá)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中各免疫基因各cDNA濃度時(shí)Ct值的大小，選擇10 ?-1 cDNA濃度為模板進(jìn)行各免疫基因相對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)（2 ?-△△Ct 法）。如圖3所示，紅鰭東方鲀免疫后6～36 h，IFN-α基因在實(shí)驗(yàn)組1中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，24 h時(shí)表達(dá)量最高;在實(shí)驗(yàn)組2中的表達(dá)量在6 h最高，隨后呈下降趨勢(shì)。IFN-γ、MHCⅠ基因在免疫后6 h表達(dá)量都出現(xiàn)最大值且實(shí)驗(yàn)組1高于實(shí)驗(yàn)組2，隨后呈下降趨勢(shì)。Mx基因的表達(dá)則出現(xiàn)上升趨勢(shì)，24 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后下降。

3 討論

經(jīng)重組的紅鰭東方鲀IFN-γ免疫后個(gè)體后，IFN-α基因的表達(dá)量在低劑量組中呈先上升后下降的趨勢(shì)，在24 h表達(dá)量相對(duì)較高，而高劑量組中其在6h表達(dá)量最高，表明高劑量組效果更好。余新建等 ?[2] 利用重組Ⅰ型干擾素免疫健康草魚，分別于免疫后6、12、24、48、72 h檢測(cè)草魚各免疫器官內(nèi)干擾素系統(tǒng)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明Ⅰ型IFN表達(dá)在24～48 h達(dá)到峰值，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，但本實(shí)驗(yàn)IFN-α表達(dá)量在36 h出現(xiàn)下降，可能是由于重組蛋白濃度及活性下降引起的。

IFN-γ的表達(dá)量在低劑量及高劑量組中均在6 h出現(xiàn)峰值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。該結(jié)果說(shuō)明紅鰭東方鲀受到重組IFN-γ蛋白免疫后，體內(nèi)IFN-γ表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，免疫作用結(jié)束，IFN-γ表達(dá)逐漸恢復(fù)到本底水平。Jung ?[3] 等以10 ng/mL 和100 ng/mL牙鲆重組IFN-γ蛋白免疫其頭腎細(xì)胞，體外培養(yǎng)后檢測(cè)IL-1β、STAT1、CXCL13、IFN-γ在6 h、24 h的表達(dá)情況;結(jié)果顯示高劑量組中IFN-γ基因在6 h表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低劑量組和對(duì)照組，低劑量組在24 h時(shí)有顯著性表達(dá)，該結(jié)果表明當(dāng)重組蛋白濃度大于100 ng/mL時(shí)，可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)IFN-γ基因的大量表達(dá)。Biswas等（2015）以50 μg/mL濃度的重組蛋白免疫紅鰭東方鲀檢測(cè)機(jī)體內(nèi)IFN-γ、IL-1β、IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子在1 d、3 d、5 d時(shí)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示IFN-γ的表達(dá)沒(méi)有顯著性變化，而IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子在1d、5d時(shí)的表達(dá)有顯著性差異，猜測(cè)IFN-γ會(huì)刺激免疫因子的不持續(xù)性表達(dá) ?[4] 。本實(shí)驗(yàn)中IFN-γ基因在高劑量組（50 μg/mL） 的表達(dá)量普遍低于低劑量組，可能是由于重組蛋白濃度過(guò)高抑制基因的短時(shí)間內(nèi)的表達(dá)，對(duì)于其長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響需要進(jìn)一步的研究探索。

MHC為主要組織相容性復(fù)合體，在特異性免疫中發(fā)揮重要作用，魚類與哺乳動(dòng)物相同均含有兩類MHC分子即MHCⅠ和MHCⅡ。當(dāng)受到外源性物質(zhì)（如病毒、細(xì)菌、其他抗原等）刺激后，機(jī)體各組織內(nèi)的MHC分子會(huì)出現(xiàn)不同水平的上調(diào)。草魚注射柱狀黃桿菌后，其頭腎中的MHCⅠ顯著性上調(diào) ?[5] 。牙鲆受愛(ài)德華氏菌感染后免疫器官中的兩類MHC分子表達(dá)量均升高 ?[6] 。本實(shí)驗(yàn)中，兩劑量組中MHCⅠ基因的表達(dá)量趨勢(shì)一致，在6 h表達(dá)量最高，且低劑量組高于高劑量組，隨后呈下降趨勢(shì)。這種現(xiàn)象可能與MHCⅠ本身的作用機(jī)制有關(guān)。MHCⅠ的主要作用是將抗原呈遞給CD +8T細(xì)胞，而CD +8T細(xì)胞具有具有抑制性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞作用 ?[7] ，在識(shí)別外源抗體，細(xì)胞攻毒方面起著重要作用。此外MHCⅠ可通過(guò)免疫細(xì)胞廣泛存在的模式識(shí)別信號(hào)通路而快速傳遞信息 ?[8] ，因此，在受到外源刺激后，紅鰭東方鲀個(gè)體內(nèi)MHCⅠ的表達(dá)量可能快速上調(diào)。

Mx蛋白是一種由IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的GTP酶動(dòng)力蛋白，目前，魚類中已從大菱鲆 ?[9] 、大西洋鮭 ?[10] 、虹鱒 ?[11] 、鯰魚 ?[12] 獲得了具有抗病毒活性的Mx蛋白。研究表明，利用poly：C感染鯰魚會(huì)引起Mx mRNA顯著上調(diào)，肌肉注射后6 h出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的增加 ?[12] 。本實(shí)驗(yàn)中Mx基因表達(dá)量在免疫后6～24 h表現(xiàn)為上調(diào)狀態(tài)，24 h表達(dá)量最大，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，低劑量組表達(dá)量總體高于高劑量組。本實(shí)驗(yàn)證明重組IFN-γ可以作用于紅鰭東方鲀誘導(dǎo)其體內(nèi)Mx基因的表達(dá)。以病毒感染魚類，免疫印跡方式檢測(cè)Mx蛋白在不同器官的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫器官在病毒刺激后Mx蛋白表達(dá)量都會(huì)增加，但肝臟中Mx蛋白的表達(dá)量在注射處理后的第三天達(dá)到峰值，第14天仍保持上升狀態(tài) ?[13] ，表明Mx蛋白的表達(dá)量較為持久。

利用魚類的天然免疫基因生產(chǎn)和制備重組免疫因子作為免疫增強(qiáng)劑取代抗生素用于水產(chǎn)生物病害的防治是重要的研究?jī)?nèi)容和發(fā)展方向。本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步研究重組免疫因子在魚類尤其是紅鰭東方鲀病害防治上的應(yīng)用提供了參考。

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