雷夢英，楊賢智，黃少彬

（1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與農(nóng)村發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)部華南都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，廣東 廣州 510640）

柑橘黃龍病是一種毀滅性病害，可以侵染絕大多數(shù)的柑橘品種及其近緣屬植物。1919年柑橘黃龍病在廣東潮汕地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，近百年來已在世界近40個國家和地區(qū)的柑橘產(chǎn)區(qū)蔓延為害［1］。近年來，我國柑橘黃龍病呈現(xiàn)不斷加劇和向北蔓延的趨勢，已從原先的25°N以南擴展到 28～29°N 區(qū)域［2］。據(jù)監(jiān)測，2017年我國新增柑橘黃龍病發(fā)生縣（市）18個，共有11個?。ㄖ陛犑校?00多個縣約16萬hm2柑橘遭受到柑橘黃龍病的為害。其中，廣東、廣西、福建、江西等柑橘種植區(qū)較為嚴(yán)重。柑橘黃龍病導(dǎo)致廣東省的貢柑和沙糖橘、福建省的永春蘆柑、江西省的贛南臍橙等種植面積銳減，部分產(chǎn)業(yè)至今未能完全恢復(fù)。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，柑橘黃龍病在廣東省為害最為嚴(yán)重，其發(fā)病面積約占全省柑橘種植總面積的25%以上，每年因柑橘黃龍病造成的損失約為50億元［3］。

關(guān)于柑橘黃龍病的研究進展，國內(nèi)外已有較多綜述。Gottwald等［4］綜述了柑橘黃龍病在美國和巴西的分布情況、病害流行規(guī)律以及對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)的影響；范國成等［5］綜述了我國1978—2009年期間有關(guān)柑橘黃龍病的研究概況，包括柑橘黃龍病的分布和為害、診斷與檢測方法、傳播途徑和防控技術(shù)等；宋曉兵等［6］介紹了柑橘黃龍病菌分離培養(yǎng)的研究進展，闡述其分子檢測鑒定技術(shù)，包括常規(guī)PCR、雙重PCR、實時熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）快速檢測技術(shù)；許美容等［7］介紹了柑橘黃龍病基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子致病機理以及寄主分子抗病機理等方面的研究概況，并提出了未來的研究方向；Munir等［8］匯總并比較了熱療法以及抗生素、油菜素內(nèi)酯、納米乳劑等方法對柑橘黃龍病的防治效果。本文主要就柑橘黃龍病菌對柑橘根系營養(yǎng)和根系基因、蛋白表達的影響進行概述，并重點就柑橘黃龍病菌重建柑橘根系微生物群落、影響柑橘根系微生物功能基因表達等最新研究進展進行綜述，旨在為系統(tǒng)開展柑橘黃龍病菌與柑橘根系互作關(guān)系的研究提供新的思路和參考。

1 柑橘黃龍病病原及其癥狀概況

1.1 柑橘黃龍病的病原菌

柑橘黃龍病的病原菌是一種韌皮部專性寄生的革蘭氏陰性細菌，暫定為薄壁菌門α-變形菌綱（Proteobacteria）候選韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberibacter）細菌，分為3個小種：亞洲型（C. L. asiaticus）、非洲型（C. L.africanus）和美洲型（C. L. americanus）［9］。柑橘黃龍病主要通過帶病接穗嫁接、帶病苗木調(diào)運和帶病木虱取食進行傳播。最新研究發(fā)現(xiàn)，盡管根系交叉生長不能傳播黃龍病，但根嫁接具備傳播黃龍病菌的能力，發(fā)病率達36.7%［10］。迄今柑橘黃龍病病原菌尚不能人工培養(yǎng)，目前尚無針對該病的有效藥劑和抗性品種，只能通過挖除病樹、殺滅木虱、種植無病毒苗木和生態(tài)隔離等措施防控柑橘黃龍病的發(fā)生和蔓延。

1.2 柑橘黃龍病的田間癥狀

柑橘黃龍病是一種系統(tǒng)性病害，其癥狀在柑橘葉片、果實和根系上均有表現(xiàn)。柑橘感染柑橘黃龍病菌后，樹勢生長緩慢，一般3個月后顯癥［11］。葉片初期呈斑駁狀，后期整體黃化、枯萎。果實變小、畸形，品質(zhì)劣變，常表現(xiàn)為“紅鼻子”果，喪失經(jīng)濟價值。新樹感病后1～2年死亡，老樹3～5年死亡［12-13］。感染黃龍病的柑橘葉片癥狀明顯，并且柑橘木虱可以通過口針進入葉脈韌皮部取食傳播柑橘黃龍病菌，因此普遍認(rèn)為柑橘黃龍病菌優(yōu)先定植于柑橘葉片，堵塞葉片韌皮部，導(dǎo)致柑橘根系碳水化合物供應(yīng)不足，進而引發(fā)根系腐爛。

2 柑橘黃龍病菌侵染柑橘根系的研究

2.1 柑橘黃龍病菌侵染柑橘根系過程的研究

在柑橘黃龍病的研究中，柑橘黃龍病菌與柑橘根系的互作關(guān)系通常會被忽略。Tatineni等［14］利用常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病菌在感病植株的花、果實、葉片中脈、樹皮和根系等組織中均有分布，并且根系中柑橘黃龍病菌的含量高于葉片中脈的含量。此外，Bassanezi等［15］在巴西圣保羅調(diào)查發(fā)現(xiàn)柑橘果實產(chǎn)量與柑橘黃龍病的嚴(yán)重程度遵從負指數(shù)模式，即甜橙感染柑橘黃龍病后雖然地上部分癥狀表現(xiàn)不明顯，但其產(chǎn)量明顯降低。該調(diào)查結(jié)果表明在柑橘地上部分表現(xiàn)出柑橘黃龍病典型癥狀前，有些未被發(fā)現(xiàn)的損害就已經(jīng)發(fā)生。Graham等［16］在美國佛羅里達州田間實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在哈母林甜橙和伏令夏橙葉片表現(xiàn)出斑駁狀和熒光定量PCR檢測出陽性結(jié)果前，其砧木Swingle枳柚（Poncirus trifoliata×Citrus paradisi）的根系干重已明顯減少。Johnson等［17］利用熒光定量PCR檢測和顯微觀察跟蹤柑橘黃龍病菌在哈姆林甜橙中的移動情況，發(fā)現(xiàn)在地上部分顯癥前，柑橘黃龍病菌就已經(jīng)在其根部大量擴繁。此外，柑橘黃龍病菌侵染根系和根系受損均發(fā)生在葉片、枝干韌皮部堵塞之前。基于上述研究結(jié)果，推斷柑橘黃龍病菌在感病早期已通過韌皮部從柑橘木虱取食部位擴展至根系，并在根系中擴繁，從而使根系成為韌皮部傳播柑橘黃龍病菌的庫。當(dāng)新的葉片長出后，柑橘黃龍病菌從根系迅速擴繁至幼葉中，導(dǎo)致地上部分顯癥。目前該推斷有待于進一步實驗驗證。

2.2 柑橘黃龍病菌對柑橘根系生理功能的影響

柑橘生命周期長，根系在其生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。柑橘根系的主要功能是將樹體固定在土壤中，吸收水分和礦物質(zhì)，儲存營養(yǎng)物質(zhì)。此外，柑橘根系還會分泌有機酸，使根際土壤中難溶性磷得以溶解，供自身吸收和利用［18］。Wu 等［19］發(fā)現(xiàn)印度酸橘幼苗嫁接帶柑橘黃龍病菌的接穗5周后，根系干重降低了42%（2013年數(shù)據(jù)）和51%（2014年數(shù)據(jù)）。此外，感染柑橘黃龍病的印度酸橘幼苗須根中的淀粉和蔗糖含量均明顯低于健康苗木。Kim等［20］在感染柑橘黃龍病的根系中觀察到細胞壁增厚、淀粉積累，甚至細胞崩潰的現(xiàn)象。Etxeberria等［21］利用掃描電鏡和透射電鏡在感染柑橘黃龍病的甜橙根系中觀察到淀粉缺失、韌皮部細胞塌陷和纖維消失等現(xiàn)象，而在其葉片、葉柄等部位均有大量淀粉積累，在莖干木質(zhì)部也有淀粉分布。碳水化合物是植物防衛(wèi)反應(yīng)的能量庫，柑橘黃龍病菌侵染柑橘導(dǎo)致根系部位的淀粉、蔗糖等碳水化合物代謝異常，根系活力下降，對柑橘疫霉菌等土傳病害的侵染更加敏感，進而導(dǎo)致柑橘根系表皮脫落，根系腐爛［22］。上述研究表明柑橘黃龍病菌破壞了柑橘根系結(jié)構(gòu)，引起根冠和根邊緣細胞脫落，粘膠等根系分泌物減少，進而影響了柑橘根系對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致根系腐爛。

2.3 柑橘黃龍病菌改變了柑橘根系基因和蛋白的表達

近年來，國內(nèi)外研究者采用芯片技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究方法初步揭示了柑橘根系響應(yīng)柑橘黃龍病菌侵染的分子機制。Aritua等［23］對感染柑橘黃龍病的瓦倫西亞甜橙根系進行了基因表達譜芯片分析，篩選出111個差異表達的基因，這些基因參與了碳水化合物代謝、生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和降解、氧化還原反應(yīng)等。Zhong等［24］采用轉(zhuǎn)錄組測序和iTRAQ技術(shù)分別分析了江西紅橘感染柑橘黃龍病后根系的基因表達和蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)差異表達基因顯著性富集的通路共19個。其中，蔗糖合成酶基因下調(diào)表達，而蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因上調(diào)表達，它們的差異表達可能與柑橘根系韌皮部堵塞、蔗糖供應(yīng)不足有關(guān)；6個植物凝集素類似蛋白-篩管蛋白（phloem protein）顯著上調(diào)表達，推測它們在篩板處沉積，堵塞維管束系統(tǒng)，參與植物防衛(wèi)反應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)柑橘感染黃龍病后，葉片中的篩管蛋白同樣上調(diào)表達［25-26］；萜類、黃酮類、苯丙烷等次生代謝物合成相關(guān)基因在柑橘葉片中上調(diào)表達，參與了對黃龍病菌的防衛(wèi)反應(yīng)［27-29］，但這些基因在感染柑橘黃龍病的柑橘根系中卻下調(diào)表達。此外，在蛋白質(zhì)組水平上獲得了與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)性強的差異表達蛋白36個（27個上調(diào)和9個下調(diào)）。其中，病程相關(guān)蛋白枯草桿菌樣蛋白酶基因上調(diào)表達3.14倍，其蛋白上調(diào)表達282倍，推測該蛋白可能通過保護根尖分生區(qū)參與柑橘根系抵御柑橘黃龍病菌過程。以上研究應(yīng)用基因表達譜芯片、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)初步解析了柑橘根系響應(yīng)柑橘黃龍病菌侵染的分子機理，為今后研究柑橘黃龍病菌侵染下的柑橘根系抗性機理提供了一些新的認(rèn)識。

3 柑橘黃龍病菌對柑橘根系微生物的影響

根際微生物和根系內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，與植物病害密切相關(guān)。這些微生物具有固氮、解磷、解鉀等作用，為植物生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，或通過分泌生長素、細胞分裂素等植物激素調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。此外，它們也可以通過直接與植物病原菌競爭，或誘導(dǎo)寄主植物抗性，提高植物對病害的廣譜抗性，保證植物健康成長［30-31］。近年來，根際微生物、根系內(nèi)生菌與植物病害關(guān)系的研究已成為植物病理學(xué)研究的熱點。

3.1 柑橘黃龍病菌改變了柑橘根際微生物的群落結(jié)構(gòu)及其功能基因的表達

柑橘黃龍病菌顯著改變了柑橘根際微生物的群落組成，同時柑橘根際微生物群落結(jié)構(gòu)的改變及其功能基因表達豐度的變化是柑橘黃龍病菌在柑橘根系中擴繁的前提條件，并與其癥狀發(fā)展相關(guān)。柑橘根際微生物分屬于8門45類83目137科183屬，其數(shù)量明顯高于柑橘葉際微生物的種類。網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)柑橘根際微生物的群落組成及其多樣性與柑橘黃龍病菌的相對豐度和發(fā)病程度相關(guān)（ANOSIM分析：R=0.592，P=0.001），柑橘黃龍病菌與伯克氏菌（Burkholderia）、微單孢菌（Micromonosporaceae）和黃單胞菌（Xanthomonadaceae）等根際微生物存在相互排斥的關(guān)系［32］。Trivedi等［33］通過構(gòu)建柑橘根際微生物的16S rDNA基因克隆文庫發(fā)現(xiàn)健康柑橘的根際微生物主要為伯克氏菌屬（Burkholderia）、柄桿菌屬（Caulobacter）、溶桿菌屬（Lysobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等植物促生菌，而感染黃龍病的柑橘則喪失了這些有益根際微生物。利用定量PCR技術(shù)進一步分析發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病菌不僅改變了柑橘根際微生物的種類，也改變了它們的相對豐度。Zhang等［34］采用宏基因組方法分析發(fā)現(xiàn)119種主要根際微生物中的50種在甜橙（砧木為Swingle枳柚）健康植株根系中的相對豐度顯著高于感染柑橘黃龍病的植株根系中的相對豐度，而Inquilinus屬、Aureimonas屬以及柑橘黃龍病菌的伴生菌Thaumarchaea屬在感染柑橘黃龍病植株根際中的相對豐度明顯增多。涂祖新等［35］通過18S rDNA PCR高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)感染柑橘黃龍病的贛南臍橙根際真菌的群落豐度比健康株低48.8%，但群落多樣性比健康株高23%，其中包括17個典型的黃龍病菌伴生真菌屬，這些伴生真菌可能與柑橘黃龍病的發(fā)生密切相關(guān)，而支頂孢屬是柑橘黃龍病菌最典型的伴減真菌。由于柑橘黃龍病菌導(dǎo)致根系腐爛，根際分泌物大量減少，從而導(dǎo)致以根際分泌物作為主要營養(yǎng)物質(zhì)的伴減真菌數(shù)量顯著減少。Trivedi等［36］利用GeoChip功能基因芯片分析了柑橘黃龍病菌對柑橘根際微生物功能基因多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)感染柑橘黃龍病的植株根際微生物參與固氮、氮循環(huán)、離子平衡等生命活動的功能基因的豐度明顯少于健康植株。Wang等［37］通過元基因組和元轉(zhuǎn)錄組分析進一步證明了感染柑橘黃龍病后，參與植物養(yǎng)分利用以及涉及植物-微生物互作和微生物間相互作用的柑橘根際微生物功能基因的相對豐度和表達水平均明顯下降。以上研究結(jié)果表明柑橘根際微生物群落與柑橘黃龍病菌存在明顯的相互作用關(guān)系。由于柑橘黃龍病菌的入侵和增殖，柑橘根際微生物群落的動態(tài)平衡被破壞，進而影響了柑橘根際微生物群落的數(shù)量、種類和基因功能的表達。

3.2 柑橘黃龍病菌重建了柑橘根系內(nèi)生細菌群落

部分種類的根際微生物可以進入植物根系的內(nèi)部，通過定殖擴繁成為根系內(nèi)生菌。根系內(nèi)生菌可促進植物生長，調(diào)控其免疫系統(tǒng)，并與植物細胞、植物體內(nèi)病原菌相互作用［38］。Blaustein 等［32］發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病菌明顯改變了伏令夏橙、紐荷爾、尾張等五種柑橘品種根系內(nèi)生菌的群落組成。感染柑橘黃龍病植株根系中土壤桿菌（Agrobacterium）、叢毛單孢菌（Comamonadaceae）、假單孢菌（Pseudomonas）的相對豐度較健康植株根系明顯減少，而慢生根瘤菌（Bradyrhizobiaceae）、伯克氏菌（B u r k h o l d e r i a）、羅丹桿菌（Rhodanobacter）華桿菌（Sinobacteraceae）等的相對豐度顯著增加。其中，慢生根瘤菌既是土壤細菌，也是根內(nèi)生菌，具有固氮能力，與寄主植物具有良好的共生效應(yīng)［39-40］，羅丹桿菌對植物病原菌具有生防效果［41］，而伯克氏菌則存在于寄主木質(zhì)部中，誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)反應(yīng)［42］。Trivedi等［43］從健康和感病的柑橘根系中分別分離得到的227種和125種不同形態(tài)的內(nèi)生細菌，具有解磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、合成生長素、誘導(dǎo)寄主抗性等功能的植物益生菌在健康植株根系中的含量明顯高于感染柑橘黃龍病植株根系中的含量。通過對柑橘根系內(nèi)生菌與感染黃龍病葉片進行離體共培養(yǎng)，利用疊氮溴乙錠-熒光定量PCR（EMA-qPCR）篩選對柑橘黃龍病菌有拮抗作用的細菌，發(fā)現(xiàn)類芽孢桿菌（Paenibacillus validus）、賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、微桿菌（Microbacterium oleivorans）、普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）等6株根系內(nèi)生細菌對柑橘黃龍病菌具有明顯的抑制效果。柑橘黃龍病菌入侵柑橘根系，重建了柑橘根系內(nèi)生細菌的群落組成。柑橘黃龍病菌一方面競爭奪取了伴減菌的生存空間和營養(yǎng)，導(dǎo)致其種類和數(shù)量減少，另一方面通過與伴生菌相互作用建立動態(tài)平衡系統(tǒng)，實現(xiàn)在柑橘根系中的入侵和繁殖。因此，盡可能挖掘出柑橘黃龍病菌的伴生菌，建立柑橘黃龍病菌及其伴生菌的共培養(yǎng)體系，可以為解決柑橘黃龍病菌無法體外培養(yǎng)的技術(shù)難題提供新的思路。此外，部分內(nèi)生菌可促進植物生長、誘導(dǎo)寄主抗性，通過分泌代謝物（如抗生素等）等方式抑制柑橘黃龍病菌的生長，但它們對柑橘黃龍病菌抑制作用的機理還需要更深入的研究。

4 研究展望

近年來，柑橘黃龍病的危害日益加劇，已成為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前尚無防治柑橘黃龍病的特效藥劑，只能通過種植無病苗木、砍除病樹、撲殺柑橘木虱等措施進行防控。柑橘黃龍病菌侵染柑橘根系導(dǎo)致根系淀粉缺失、生物量降低，根系蔗糖代謝、抗病相關(guān)基因和蛋白表達異常。此外，柑橘黃龍病重建了柑橘根際微生物和根系內(nèi)生細菌群落，影響了柑橘根際微生物功能基因的表達。因此柑橘黃龍病菌與柑橘根系互作關(guān)系的研究對探究柑橘黃龍病菌的致病機理具有重要的意義。關(guān)于柑橘黃龍病菌與柑橘根系互作關(guān)系的研究，以下幾個方面仍需深入拓展：

（1）進一步闡述柑橘黃龍病菌的致病機理。Johnson等［17］認(rèn)為感染柑橘黃龍病后柑橘根系受損，并不是由于地上部分韌皮部堵塞導(dǎo)致的根系碳水化合物缺乏，而是柑橘黃龍病菌對柑橘根系的直接破壞。柑橘黃龍病菌侵染柑橘根系，直接導(dǎo)致根系生物量減少，根系活力降低，并與土傳病害相互作用導(dǎo)致對根系的進一步傷害［16］。為了進一步分析柑橘黃龍病菌與柑橘根系的互作關(guān)系，需從病原菌的角度，利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等方法解析柑橘黃龍病菌侵染柑橘根系的機理，尋找其關(guān)鍵致病因子。

（2）柑橘黃龍病菌影響柑橘根際土壤微生物群落和功能基因表達的機理有待于進一步解析。目前的研究僅從根際營養(yǎng)供應(yīng)的角度解釋柑橘黃龍病菌對柑橘根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等方面的影響。感染黃龍病的柑橘根系營養(yǎng)供應(yīng)不足，為根際微生物提供營養(yǎng)的根系分泌物減少［36］，導(dǎo)致柑橘根際土壤微生物和根系內(nèi)生菌的群落組成、結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生了顯著的改變。進一步導(dǎo)致涉及固氮、磷吸收、離子平衡和抗性等方面的根際土壤微生物功能基因的總體表達水平明顯降低。而從柑橘黃龍病菌-柑橘根系-根際微生物三者的互作關(guān)系出發(fā)，可以系統(tǒng)闡述柑橘黃龍病菌影響柑橘根際土壤微生物群落、功能基因表達的機理。

（3）柑橘有益根際微生物和根系內(nèi)生菌的發(fā)掘和利用。柑橘根際土壤微生物、根系內(nèi)生菌與柑橘黃龍病菌密切相關(guān)，有益微生物對柑橘根系的生長發(fā)育起促進和保護作用，一些根系內(nèi)生菌對柑橘黃龍病菌具有各種各樣的抑制作用［43］。因此，進一步發(fā)掘和利用柑橘根際土壤微生物群體和根系內(nèi)生菌，發(fā)揮有益微生物的根際效應(yīng)，提高它們對柑橘黃龍病菌的拮抗效果，減少根系中黃龍病菌數(shù)量，從而減緩柑橘黃龍病的發(fā)生和流行。