冀頤之，趙有璽，程艷玲，劉濤，楊昊，龔平

（北京聯(lián)合大學生物化學工程學院生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室，北京100023）

纖維素是世界上產(chǎn)量最大的一類可降解、可再生的能源物質(zhì)，它存在于各種有機固體廢棄物中，如秸稈、谷殼、水果渣中。我國秸稈資源豐富，發(fā)改委和農(nóng)業(yè)部2015年聯(lián)合公布的數(shù)據(jù)，全國秸稈理論資源量為10.4億噸，可收集資源量為9億噸[1]。畜禽糞便是另一類產(chǎn)量巨大且纖維素含量豐富的有機固體廢棄物。據(jù)行業(yè)統(tǒng)計，全國每年產(chǎn)生38億噸畜禽糞污，綜合利用率不到60%[2-3]。我國食品工業(yè)每年產(chǎn)生大量的水果副產(chǎn)物，如蘋果渣、菠蘿渣等富含木質(zhì)纖維素的果渣[4-5]。利用這些有機廢棄物生產(chǎn)附加值較高的黃腐酸，可實現(xiàn)農(nóng)作物、水果副產(chǎn)物的資源化利用，產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。

腐植酸（humic acid，HA）是生物有機質(zhì)在微生物的分解轉(zhuǎn)化下，經(jīng)由長期的反應和積累，而得到的一類結(jié)構功能十分復雜的混合物[6]。按照不同的溶解性，將腐植酸分為三大類：溶于酸、堿和水的為黃腐植酸；溶于乙醇、堿的為棕腐植酸；只溶于堿的為黑腐植酸[7-8]。其中黃腐酸（fulvic acid，F(xiàn)A）是最具活性的一種成分，與腐植酸其他成分相比，具有分子量小，滲透能力強，易被生物吸收利用，功能團含量多，生物活性大等特點[9]。作為改良土壤劑[10]、促進植物生長發(fā)育劑[11]、植物生長調(diào)節(jié)劑[12]、飼料添加劑[13]等在農(nóng)業(yè)領域中獲得了迅速的推廣和應用，具有重要發(fā)展?jié)摿?。提高腐植酸中黃腐酸的含量，可提升堆肥品質(zhì)，是一條資源化利用的高效途徑。目前，國內(nèi)生物腐植酸的研究與生產(chǎn)還處于初級階段，生物腐殖酸的發(fā)酵主要是人工堆建發(fā)酵法[14]，而性能優(yōu)良的黃腐酸生產(chǎn)菌株的篩選對于縮短發(fā)酵周期、提升堆肥品質(zhì)起著關鍵的作用。

發(fā)酵床養(yǎng)殖是近幾年國家大力推廣的一種現(xiàn)代化生態(tài)養(yǎng)殖模式。利用微生物，在以木屑等構成的發(fā)酵床中，高效分解畜禽排泄的糞尿、消除惡臭，并最終將糞尿轉(zhuǎn)化形成人工腐植質(zhì)，同時實現(xiàn)了禽畜養(yǎng)殖污染的原位微生物治理和廢棄物的資源化利用，是一種全新的環(huán)境養(yǎng)殖方式[15]。發(fā)酵床在自然發(fā)酵過程中富集了豐富的土著微生物資源，其中墊料主要是由椰糠、谷殼、木屑等高纖維材料構成，在發(fā)酵后期，可形成大量的腐植酸[16]。特定的生存環(huán)境為篩選高效降解木質(zhì)纖維素生產(chǎn)黃腐酸的菌株提供了可靠來源[17-18]。

本論文以北京京郊奶牛養(yǎng)殖場發(fā)酵床土著微生物為基礎，分離篩選黃腐酸生產(chǎn)菌株，為采用微生物技術進行農(nóng)業(yè)和食品業(yè)有機固體廢棄物的資源化利用，提升產(chǎn)品品質(zhì)，實現(xiàn)循環(huán)農(nóng)業(yè)和低碳經(jīng)濟提供奠定一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種分離來源

發(fā)酵床樣品：北京京郊某奶牛養(yǎng)殖場。

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.2～7.4。

放線菌分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO31 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.2～7.4。使用前每升培養(yǎng)基中加入3%重鉻酸鉀溶液3.3 mL。

霉菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，孟加拉紅 33.4 mg/L，pH自然。滅菌后每升培養(yǎng)基中加入1%鏈霉素3 mL。

種子培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 自然。

玉米秸稈固態(tài)培養(yǎng)基：40目玉米秸稈粉20 g，（NH4）2SO40.5 g，麩皮1 g，蔗糖 0.15 g配料時加水混勻，物料水分以手捏混合料能成塊，指尖有水滲出但不滴落為宜，裝入500 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

生化培養(yǎng)箱（LRH-150型）：上海一恒科學儀器有限公司；高溫高壓滅菌鍋（GI54T型）：致維儀器有限公司；單人單面凈化工作臺（SW-CJ-1FD型）：蘇州凈化有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc2000型）：美國伯樂（Bio-RAD）公司；PCR擴增儀（ABI9700型）：美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 耐高溫菌株的篩選

稱取10 g發(fā)酵床樣品，放入盛有100 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10 min后，分別吸取菌液進行梯度法稀釋，并取適宜稀釋度的液體分別涂布于細菌分離培養(yǎng)基、放線菌、霉菌分離培養(yǎng)基平板，倒置于45℃恒溫箱中培養(yǎng)。挑取平板上生長良好，且形態(tài)特征不同的單菌落，進一步純化后，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)，并置于冰箱4℃條件下保存。

1.3.2 黃腐酸生產(chǎn)菌株的篩選

將初篩菌株以10%的接種量接入玉米秸稈固態(tài)培養(yǎng)基中，45℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 d。發(fā)酵過程每天補充無菌水5 mL，以補充蒸發(fā)的水分。

1.3.3 黃腐酸生產(chǎn)菌株的分類鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學特征

將純化后的菌株接種于LB固體平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后觀察其菌落生長情況和形態(tài)。挑取單個菌落制成玻片，革蘭氏染色[19]，置于光學顯微鏡下，400×，觀察各菌株的顯微形態(tài)。

1.3.3.2 分子生物學鑒定

采用細菌菌株的通用引物：正向引物27F 5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物 1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；進行菌落 PCR，擴增16srDNA。

PCR反應體系：10×Buffe（r含Mg2+）2 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL，F(xiàn)（10 μmol/L）2 μL，R（10 μmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，加雙蒸水至 20 μL。

PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸 90 s，25個循環(huán)；72℃修復延伸7 min；最后4℃終止反應。

擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后的產(chǎn)物測序后獲得的16SrDNA序列，登錄http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站，用Blast程序進行序列比對分析，選取與之相似性高的菌16SrDNA序列，使用MEGA 5.0軟件比對、分析、構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1000次進行穩(wěn)定性驗證。

1.3.4 纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的測定

參考侯勇等[20]的方法，進行纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的測定。

其中降解率計算公式為：

式中：C1為發(fā)酵前纖維素含量，g；C2為發(fā)酵后纖維素含量，g。

式中：H1為發(fā)酵前半纖維素含量，g；H2為發(fā)酵后半纖維素含量，g。

式中：L1為發(fā)酵前木質(zhì)素含量，g；L2為發(fā)酵后剩余木質(zhì)素含量，g。

1.3.5 黃腐酸的測定

采用重鉻酸鉀氧化法進行黃腐酸測定[20]。

其中黃腐酸產(chǎn)量計算公式為：

式中：B1為發(fā)酵前體系中黃腐酸含量，g/kg；B2為發(fā)酵后體系中黃腐酸含量，g/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫菌株的篩選

生化黃腐酸發(fā)酵通常采用高溫好氧發(fā)酵工藝，發(fā)酵中期溫度會上升至45℃以上進入高溫發(fā)酵階段，嗜溫微生物生長繁殖受到抑制[21-22]，因此黃腐酸發(fā)酵需要篩選嗜熱性微生物。從奶牛養(yǎng)殖場發(fā)酵床中采樣，通過平板稀釋法涂布于細菌分離培養(yǎng)基、放線菌、霉菌分離培養(yǎng)基平板上，45℃培養(yǎng)4 d。試驗發(fā)現(xiàn)，放線菌、霉菌分離培養(yǎng)基上并未有菌落生長。從細菌分離培養(yǎng)基上選取生長良好的嗜熱性微生物，并根據(jù)不同菌種形態(tài)特征，最終篩選出7株菌，分別編號為：DLS01、DLS02、DLS03、DLS04、DLS05、DLS06、DLS07 作為本研究初篩耐高溫發(fā)酵菌株，用于后續(xù)試驗。

2.2 黃腐酸生產(chǎn)菌株的篩選

2.2.1 分離菌株黃腐酸產(chǎn)量的測定

將初篩獲得的7株耐高溫菌株接種于玉米秸稈固態(tài)培養(yǎng)基中，45℃發(fā)酵20 d，測定其黃腐酸含量。分離菌株的黃腐酸產(chǎn)量見圖1。

圖1 分離菌株的黃腐酸產(chǎn)量Fig.1 The fulvic acid production of the isolated strains

從圖1可知，7株菌均能生產(chǎn)黃腐酸，其中DLS07號菌黃腐酸含量最高，達到69.67g/kg，具有較好的黃腐酸生產(chǎn)性能。利用有機固體廢棄物生產(chǎn)黃腐酸，其原料中木質(zhì)纖維素含量較高，難以利用，大大的限制了發(fā)酵的進程[23]，生產(chǎn)菌株木質(zhì)纖維素降解能力對發(fā)酵有著非常重要的影響，因此同時考察了7株黃腐酸生產(chǎn)菌對木質(zhì)纖維素的降解能力。

2.2.2 分離菌株木質(zhì)纖維降解率的測定

將以上7株菌接入玉米秸稈固態(tài)培養(yǎng)基中，45℃發(fā)酵20 d，測定其對木質(zhì)纖維素的降解率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 分離菌株的木質(zhì)纖維素降解率Fig.2 The degradation rate of cellulose，hemi cellulose and lignin by the isolated strains

從圖2中可以看出纖維素降解率最大的為菌株DLS07，降解率為29.26%。其次為菌株DLS01和DLS06，纖維素降解率分別為26.4%和24.77%；半纖維素降解能力最強的菌株仍是DLS07，其半纖維素降解率可達到40.33%，其余菌株半纖維素降解能力相差不大，在34%～40%左右；通過微生物發(fā)酵，各試驗組木質(zhì)素降解幅度在3%～21%之間，由圖2可知，降解木質(zhì)素能力最強的菌株是DLS03，其降解率為21.11%，而DLS07對木質(zhì)素的降解能力表現(xiàn)一般，僅為16.6%。

天然木質(zhì)纖維素中纖維素同半纖維素交聯(lián)，并被與半纖維素共價相連的木質(zhì)素所包裹，從而形成了一個高度有序的致密結(jié)構，難以處理和利用[24-25]。在自然狀態(tài)下，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分解是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果。采用多菌株混合發(fā)酵，利用不同菌種間酶的多樣性，可提高纖維素的轉(zhuǎn)化率[24]。菌株DLS07具有良好的黃腐酸生產(chǎn)性能及纖維素、半纖維素降解能性能，而木質(zhì)素降解性能一般。菌株DLS03具有良好的木質(zhì)素降解能性能。兩株菌又同為養(yǎng)殖場發(fā)酵床土著微生物，可形成穩(wěn)定的復合體系，因此選擇DLS3和DLS07進行復合菌劑發(fā)酵試驗。

2.2.3 黃腐酸復合菌劑發(fā)酵試驗

選擇DLS03和DLS07，1∶1進行復配，在玉米秸稈固態(tài)培養(yǎng)基中進行黃腐酸發(fā)酵試驗，20 d后測定其生化黃腐酸含量，復配試驗組生化黃腐酸含量達到了76.73 g/kg，較DLS03、DLS07單菌發(fā)酵的黃腐酸產(chǎn)量47.93、69.63 g/kg分別高出37%、9%，說明復合發(fā)菌劑發(fā)酵可以更為有效的降解有機固體廢棄物中的木質(zhì)纖維素，將其轉(zhuǎn)化為具有生物活性物質(zhì)黃腐酸，使其變廢為寶，現(xiàn)實生態(tài)循環(huán)。復合菌劑和單菌發(fā)酵的木質(zhì)纖維素降解率見圖3。

圖3 復合菌劑和單菌發(fā)酵的木質(zhì)纖維素降解率Fig.3 The degradation rate of cellulose，hemi cellulose and lignin by the mixed cultures and single strain

復合菌劑的木質(zhì)纖維素降解率測定結(jié)果表明，微生物經(jīng)過復配之后，對纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率均有所提高，結(jié)果如圖3所示，分別達到32.87%、45.46%、44.55%，比降解率較好的單菌發(fā)酵試驗組分別提高了7%、11%、11%。木質(zhì)纖維素降解是腐植質(zhì)發(fā)酵過程中的限速步驟[23]，在復合菌劑在微生物的共同作用下，增強了底物的降解效率，為黃腐酸的合成提供了更多的前體物質(zhì)，進一步提高了黃腐酸產(chǎn)量。

2.3 菌株DLSO3、DLS07的鑒定及進化樹構建

2.3.1 菌落形態(tài)特征觀察

37℃培養(yǎng)24 h后對菌株DLS03、DLS07進行菌落形態(tài)及顯微特征的觀察，對應的菌落特征和顯微特征結(jié)果見表1。

表1 菌株菌落形態(tài)及顯微特征Table 1 Colonial and microscopic characteristics of the isolatedstrains

2株菌均屬于細菌，電子顯微鏡下觀察革蘭氏染色后個體形態(tài)圖如圖4所示，DLS03、DLS07均為革蘭氏陽性菌，顯微下兩種菌均呈桿狀。

圖4 菌株DLS03和DLS07的革蘭氏染色觀察Fig.4 Gram staining of strain DLS03 and DLS07

菌株DLS03和DLS07的菌落形態(tài)觀察見圖5。

圖5 菌株DLS03和DLS07的菌落形態(tài)觀察Fig.5 Colonial characteristics of strain DLS03 and DLS07

2.3.2 分子生物學鑒定

菌株DLS03和DLS07的16S rDNA PCR擴增結(jié)果見圖6。

圖6 菌株DLS03和DLS07的16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.6 Electrophoresis of PCR amplification products of bacterial 16S rDNA from DLS03 and DLS07

分析了菌株DLS03、DLS07的16S rRNA基因序列，其片段長度均為1 456 bp，經(jīng)基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)DLS03與Bacillus subtillis strain ccm9相似度最高為100%，DLS07與Bacillus liDLSeniformis strain CGMCC 2876相似度最高為99%，基于它們的16S rRNA基因序列所構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖7、8。根據(jù)試驗結(jié)果，初步確認DLS03為枯草芽孢桿菌，DLS07為地衣芽孢桿菌。

圖7 菌株DLS03 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain DLS03 based on 16S rDNA sequence

圖8 菌株DLS07的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain DLS07 based on 16S rDNA sequence

3 結(jié)論

以北京京郊奶牛養(yǎng)殖場發(fā)酵床土著微生物為基礎，經(jīng)分離篩選獲得7株45℃條件下生長良好的耐高溫菌株，其中DLS03和DLS07菌株是具有良好木質(zhì)素纖維素降解能力的黃腐酸生產(chǎn)菌株，經(jīng)16S rDNA基因序列分析，初步確認DLS03為枯草芽孢桿菌，DLS07為地衣芽孢桿菌。這一結(jié)果和相關文獻報道基本一致[14-15，26]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵床墊料中存在著種類多樣的芽孢桿菌，是主要的土著菌種。芽孢桿菌生長迅速，承擔了發(fā)酵菌群中高溫發(fā)酵的工作，可分解復雜有機物，具有木質(zhì)纖維素分解能力[15，26]。而黃腐酸的形成與木質(zhì)纖維素的降解存在的一定的關系，其中腐殖酸形成的多酚學說認為微生物將秸稈等降解成酚類和氨基酸類，化學氧化后，兩者聚合形成腐殖質(zhì)[28]。微生物發(fā)酵床主要成分為椰糠和谷殼等高纖維材料，所構建出的生存環(huán)境適合于能降解纖維的微生物生存[14]，選取發(fā)酵床作為菌種來源，有利于高效利用木質(zhì)纖維素的黃腐酸生產(chǎn)菌株的發(fā)現(xiàn)，目前還未見此類報道。

目前，越來越多的研究表明，高纖維固體廢棄物的降解，主要依賴于纖維素、半纖維素、木質(zhì)素分解菌株的協(xié)同作用，多菌混合發(fā)酵，可提高纖維素的轉(zhuǎn)化率[27，29]。因此，選擇將篩選所得能較好降解纖維素、半纖維素的黃腐酸生產(chǎn)菌株DLS07與木質(zhì)素降解能力較好的菌株DLS03進行1∶1復配，發(fā)酵生產(chǎn)黃腐酸，研究表明，復合菌劑試驗組纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率及黃腐酸產(chǎn)量均高于單菌發(fā)酵。目前，黃腐酸發(fā)酵菌劑的復配多采用降解木質(zhì)纖維素的真菌與黃腐酸產(chǎn)量較高的細菌共同混合的方式[30-31]，而芽孢桿菌相比霉菌、酵母等真菌具有更好的高溫耐受性[32]。本論文所篩選的復配菌株DLS03和DLS07均為芽孢桿菌，具有耐高溫，耐受不良環(huán)境等特點，將其開發(fā)為復配菌劑資源化利用有機固體廢棄物生產(chǎn)黃腐酸更具發(fā)展?jié)摿?，為腐植酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了有利的技術支撐。

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