王國澤，劉達(dá)玉，余華，郭秀蘭，左福元，朱智

（1.西南大學(xué)，重慶402460；2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都610106）

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，廣泛存在自然界，被視為極具潛質(zhì)且最廉價(jià)的生物可再生能源[1]。在纖維素降解方面國內(nèi)外已進(jìn)行了多項(xiàng)研究，其微生物降解是較受關(guān)注的研究之一[2]。纖維素降解菌消耗纖維素并維持自身生長，同時(shí)將纖維素轉(zhuǎn)化為具有利用價(jià)值的能源物質(zhì)，這類降解菌主要包括真菌、細(xì)菌、放線菌[3-4]，而部分纖維降解菌屬于嚴(yán)格厭氧菌如黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等[5]，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌纖維分解活性很高，在反芻家畜瘤胃內(nèi)大量存在，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法很難對(duì)這種微生物進(jìn)行定性和定量研究，因此，能否有效分離提取并確定其數(shù)量，對(duì)纖維素轉(zhuǎn)化為可再生能源研究應(yīng)用具有重要影響。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、反應(yīng)迅速、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)[6]，該技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針或熒光結(jié)合染料，利用實(shí)時(shí)積累的熒光信號(hào)監(jiān)測整個(gè)擴(kuò)增過程[7]，目前已被廣泛應(yīng)用于生物食品及醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，成為分子生物學(xué)中研究基因表達(dá)的常用方法[8]。迄今，關(guān)于利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)霍亂弧菌[9]、大腸桿菌[10]、沙門氏菌[11]等已有相關(guān)研究報(bào)道，但利用本方法對(duì)厭氧型纖維降解菌產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的定性定量相關(guān)研究較少，從而制約了其進(jìn)一步開發(fā)利用。本試驗(yàn)通過提取瘤胃液細(xì)菌脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA），利用SYBR Premix Ex Taq熒光染料嵌合法和人工合成基因技術(shù)對(duì)產(chǎn)琥珀酸進(jìn)行絕對(duì)定量，以期建立優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)纖維降解菌測定的體系方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山羊瘤胃液：西南大學(xué)牧場；型號(hào)為DP302細(xì)菌基因組DNA試劑盒：天根生化科技（北京）；TaKaRa Code.9160EASY Dilution、SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa Code.RR820A）、DNA標(biāo)準(zhǔn)品：寶生物工程（大連）有限公司。

Centrifuge 5804R高速臺(tái)式離心機(jī)：艾本德中國有限公司；Nano Drop ND-1000紫外分光光度儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂公司；TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa Code.TP600）、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System（TaKaRa Code.TP800）：寶生物工程（大連）有限公司；水浴槽：廈門邁凱倫精瑞科儀有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取瘤胃細(xì)菌基因組DNA

將山羊瘤胃液通過4層紗布過濾，將濾液分裝于5 mL離心管中，取濾液1.5 mL，采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒法[5]提取細(xì)菌基因組DNA，提取后取1用瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度，用TE緩沖液（Tris-EDTA buffer solution）將所有樣品標(biāo)定至100 ng，保存于-20℃待用。

1.2.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

PCR擴(kuò)增引物序列通過在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中進(jìn)行比對(duì)，確定引物和探針的理論特異性，序列見表1，由大連寶生物公司合成提供。

表1 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌引物序列Table 1 The Fibrobacter succinogenes’Primer sequence

DNA標(biāo)準(zhǔn)品采用人工合成基因方法構(gòu)建提供。用EASY Dilution將構(gòu)建的DNA標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋（5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL）作為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 建立并優(yōu)化Real Time PCR檢測體系

采用25uL反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，其中 SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plμs）為 12.5，上下游引物各1，模板為2，dH2O為8.5。反應(yīng)條件為95℃變性30 s；95℃5 s，62℃30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析參考Morisset D等[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總DNA提取效果

將用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取得到的15份瘤胃液細(xì)菌基因組DNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

圖1 瘤胃液細(xì)菌基因組DNA樣品普通電泳圖Fig.1 Rumen fluid’s bacterial DNA ordinary electrophoresis

由圖 1可知 M-1為Marker，標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品（10ng/μL），圖中對(duì)應(yīng)上表序列1-15為原液上樣2 μL，電泳結(jié)果條帶清晰，可滿足后期試驗(yàn)需要。

2.2 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

將產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒以5×100的10倍倍比進(jìn)行一系列稀釋，結(jié)果見圖2。由圖2可知，DNA 標(biāo)品在 5×100～5×108之間，曲線呈 S 型，具有較好的線性關(guān)系，表明構(gòu)建的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品可以得到較好的擴(kuò)增曲線。

2.2.2 溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線見圖3。

圖2 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

圖3 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線Fig.3 Solubility curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

從圖3中可以看出，溫度在86.5℃時(shí)，所有標(biāo)品峰值達(dá)到最高，且溶解曲線峰形單一，表明構(gòu)建的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品純度高，符合試驗(yàn)需要。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

從圖4中可知，橫坐標(biāo)為質(zhì)粒DNA梯度稀釋對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值（Initial Quantity），縱坐標(biāo)為達(dá)到熒光域值所需的閾值循環(huán)數(shù)（2ndDerivatitive Max，Ct），構(gòu)建的質(zhì)粒 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-3.478LOG（X）+37.40，相關(guān)系數(shù)為R2=1，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.47，結(jié)果表明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品能夠滿足后續(xù)絕對(duì)定量需要。

2.3 樣品DNA的Real Time PCR檢測結(jié)果

樣品DNA的擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖5。

圖5 樣品DNA的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig.5 Solubility curves and amplification curves of DNA samples

由圖5可知，15種DNA樣品的溶解曲線均為單峰，且溶解溫度在86.5℃左右，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，參考設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性。所有樣品的擴(kuò)增曲線呈S型，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增效率較高（93.9%），表明本試驗(yàn)反應(yīng)條件及參數(shù)設(shè)定合理，本方法特異性良好。因此，通過熒光定量PCR擴(kuò)增儀自動(dòng)記錄結(jié)果與構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合，可計(jì)算出樣品中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量。

3 討論

纖維素是反芻動(dòng)物主要的飼料來源，細(xì)菌和真菌在分解利用纖維素過程中起主要作用，其纖維分解菌扮演重要角色[13]，琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是瘤胃內(nèi)纖維素和半纖維素的主要消化細(xì)菌[14-15]。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌為革蘭氏陰性菌，不運(yùn)動(dòng)，纖維分解活性很高，是瘤胃纖維分解菌的優(yōu)勢菌株之一，其純培養(yǎng)菌降解結(jié)構(gòu)性堅(jiān)韌物質(zhì)（如秸稈）能力很強(qiáng)，可降解兩種瘤胃球菌所不能降解的某些同質(zhì)異晶體纖維素，成為研究纖維素酶最早的瘤胃菌株之一[16]。王夢芝等[17]研究表明，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌產(chǎn)生的酶有獨(dú)立的纖維催化區(qū)和纖維素結(jié)合區(qū)，具有很強(qiáng)的纖維降解能力，并且能夠降解一些黃色瘤胃球菌與白色瘤胃球菌所不能降解的纖維素，在纖維素分解中占主導(dǎo)地位。因此，充分挖掘利用琥珀酸絲狀桿菌的纖維降解能力，能夠?qū)⒆匀唤缰芯哂欣脙r(jià)值的纖維素物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀蝗藗兝玫哪茉次镔|(zhì)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)克服傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法中培養(yǎng)基選擇局限、厭氧影響等因素，能夠檢測到微生物數(shù)量低于1%的細(xì)菌[18]，利用SYBR Green染料或Taq－Man探針對(duì)熒光信號(hào)積累情況實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[19]，目前該項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腸道微生物菌群的研究中。唐吉思等[20]根據(jù)牛乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A基因（sea），建立了seaDNA的SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99。杜雄偉等[11]針對(duì)沙門氏菌invA基因設(shè)計(jì)特異引物，建立SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，結(jié)果特異性良好，組間組內(nèi)重復(fù)性良好。譚翰清等[21]利用克羅諾桿菌MMS基因高保守序列，設(shè)計(jì)特異引物和Taq-Man-MGB探針，試驗(yàn)結(jié)果顯示，構(gòu)建方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2=0.999，擴(kuò)增效率為99.972%。本試驗(yàn)采用熒光染料SYBR Premix Ex Taq與DNA結(jié)合，采用線性化質(zhì)粒所構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系為R2=1，DNA樣品試驗(yàn)結(jié)果溶解曲線峰值單一，擴(kuò)增曲線呈S型，擴(kuò)增效率為93.9%，線性關(guān)系良好。以上結(jié)果表明，本研究方法可有效測定瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量。

4 結(jié)論

采用細(xì)菌基因組試劑盒方法提取瘤胃細(xì)菌DNA效果明顯。Real Time PCR檢測結(jié)果顯示，構(gòu)建的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品可以得到較好的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶解曲線峰形單一，檢測樣品獲得較好Ct值。應(yīng)用構(gòu)建的Fibrobacter succinogenes特異性檢出用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可對(duì)實(shí)際樣品中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌進(jìn)行定量研究。

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