譚萍，方玉梅，周斯弼

（六盤水師范學(xué)院，貴州六盤水553004）

苦蕎麥，蓼科雙子葉植物，俗稱苦蕎。一年生草本植物。我國大量種植苦蕎麥，現(xiàn)種植面積及產(chǎn)量居全球第一[1]。性味苦、平、寒是苦蕎麥的特征，且有益氣、提神、降氣、健胃、利耳明目等作用，生理功能有防治冠心病、降血糖、高血壓、抗菌、抗病毒、抗癌、防止內(nèi)出血、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等多種功能[2-4]。根據(jù)研究表明苦蕎麥中富含的活性肽與生理功能和藥用價(jià)值有一定的關(guān)聯(lián)。

近幾年來，活性肽已引起了世界各國家食品營養(yǎng)及醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。如我國王竹清[5]等研究了生物活性肽及其研究進(jìn)展；崔霞[6]等研究酶法水解苦蕎麥活性肽有7種人體必需氨基酸；崔霞[2]等研究了苦蕎麥活性肽的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)；安毅[7]等研究大豆蛋白活性肽在功能性食品中的應(yīng)用及發(fā)展前景；張宇昊[8]等研究花生短肽降血壓活性；郭曉娜[9]等研究苦蕎麥蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究。綜上所述，活性肽具有降血壓、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功能。

由于活性肽具有多種生理功能，許多研究者將活性肽用于飲料研究。例如：李俠[10]等研制大豆-蕎麥多肽復(fù)合營養(yǎng)飲料；馬龍[11]等研究雞骨多肽保健飲品工藝；鞏婷婷[12]等研究大豆活性肽飲料；范鎮(zhèn)基[13]等研究玉米肽解酒飲料；馬平[14]等研究人參乳清蛋白多肽飲料的穩(wěn)定性及活性；譚斌[15]等研究橙汁花生肽飲料、鮑九枝[16]等研究大鯢肉活性肽飲料等。但對(duì)苦蕎麥活性肽飲料的研究很少，目前苦蕎麥加工制作的產(chǎn)品主要以苦蕎茶、蕎麥面包、蕎酥、苦蕎醋等初級(jí)加工產(chǎn)品為主，只有周小理[1]等研究苦蕎多肽營養(yǎng)飲料，但該飲料尚未形成產(chǎn)品上市。本研究以此為切入點(diǎn)深入研究活性肽蕎茶飲料，不僅滿足市場(chǎng)對(duì)苦蕎麥活性肽產(chǎn)品多樣化的需求，而且對(duì)蕎麥的深加工和開發(fā)我國蕎麥特色資源具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦蕎麥肽：六盤水師范學(xué)院生命科學(xué)系植物生理實(shí)驗(yàn)室所制；蕎麥：六苦4號(hào)；蜂蜜：惠宜-蜂蜜-蘭溪市鴻香生物科技有限公司；胰蛋白胨：北京力高興業(yè)科技有限公司；酵母浸膏：濟(jì)南杰輝商貿(mào)有限公司；葡萄糖：新沂市英會(huì)工貿(mào)有限責(zé)任公司；瓊脂：河南中偌生物科技有限公司；DPPH：西安熱默爾生物科技有限公司；無水乙醇：蘇州市祿浩化工原料有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

三洋高壓滅菌鍋：SANYO；萬能電爐：深圳市寶安區(qū)新安晶藝電熱器設(shè)備商行；PHS-2C精密酸度計(jì)：上海虹益儀器表有限公司；FA2014電子天平：重慶市松朗電子儀器有限公司；TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)：蘇州業(yè)之峰離心機(jī)制造有限公司；722型可見分光光度計(jì)：上海馳唐儀器：實(shí)業(yè)有限公司；DHP-9270B恒溫培養(yǎng)箱：北京林茂科技有限公司；202A-3型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：東莞市華凱檢測(cè)設(shè)備科技有限公司；JJ-CJ-2F超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 活性肽蕎茶飲料工藝流程

1.3.2 活性肽蕎茶飲料感官評(píng)價(jià)

根據(jù)飲料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[17]，設(shè)計(jì)活性肽蕎茶飲料感官評(píng)價(jià)表，由對(duì)飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)熟悉的10位實(shí)驗(yàn)室人員（♂：5、♀：5）進(jìn)行評(píng)分，滿分 100 分，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 活性肽蕎茶飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Active peptide buckwheat tea beverage sensory evaluation criteria

1.3.3 活性肽蕎茶飲料配方單因素試驗(yàn)

影響活性肽蕎茶飲料的因素有苦蕎茶的添加量，苦蕎麥肽、蜂蜜的添加量，通過設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)來確定影響活性肽蕎茶飲料的各個(gè)因素的添加量。

1.3.3.1 自制苦蕎茶

苦蕎米經(jīng)清洗、烘干、炒制后得到自制苦蕎茶。

1.3.3.2 苦蕎茶添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料感官的影響

取苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、蜂蜜的添加量為4%，苦蕎茶添加量分別為3%、4%、5%、6%、7%，并取100 mL苦蕎茶與其混合均勻。根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定苦蕎茶最佳添加量。

1.3.3.3 蜂蜜的添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料感官的影響

苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、苦蕎茶的添加量為5%，蜂蜜添加量分別為3%、4%、5%、6%、7%，并取100 mL苦蕎茶與其混合均勻。根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定蜂蜜最佳添加量。

1.3.3.4 苦蕎麥活性肽添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料感官的影響

苦蕎茶添加量為5%、蜂蜜的添加量為4%，苦蕎茶活性肽添加量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，并取100 mL苦蕎茶與其混合均勻。根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定苦蕎茶活性肽最佳添加量。

1.3.4 活性肽蕎茶飲料配方正交試驗(yàn)

為了獲得活性肽蕎茶飲料的最佳配方，根據(jù)單因素試驗(yàn)所確定的苦蕎活性肽、苦蕎茶、蜂蜜的最適添加量，對(duì)苦蕎活性肽、苦蕎茶、蜂蜜添加量進(jìn)行L9（33）正交設(shè)計(jì)如表2，通過感官評(píng)價(jià)分析確定飲料中苦蕎活性肽、苦蕎茶、蜂蜜的添加量。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 L9（33）Level table of orthogonal experimental design factors

1.3.5 滅菌條件對(duì)活性肽蕎茶飲料感官的影響

王若敏[18]等報(bào)道活性肽較穩(wěn)定，在80℃～100℃條件下活性有最高值，為保證苦蕎麥活性肽的功能性，活性肽蕎茶飲料的滅菌條件設(shè)計(jì)為75℃20 min、85℃20 min、95 ℃ 20 min、105 ℃ 20 min、115 ℃ 20 min，根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定最適的滅菌條件。

1.3.6 活性肽蕎茶飲料微生物檢測(cè)

按照GB4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》，微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：菌落總數(shù)≤100 CFU/mL。微生物檢測(cè)步驟[19-20]：配制平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基，無菌操作條件下，將15 mL～20 mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可以放在46℃左右的恒溫水浴保溫）倒入培養(yǎng)皿，用移液槍取經(jīng)過滅菌的活性肽蕎茶飲料1 mL注入培養(yǎng)基平板內(nèi)，并轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其混合均勻。同時(shí)，分別吸取1mL無菌水加入培養(yǎng)基內(nèi)作空白對(duì)照。等待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（72±3）h觀察。觀察菌落時(shí)可用肉眼觀察，在必要的條件下可用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄相應(yīng)的菌落數(shù)量。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基成分：2.5 g胰蛋白胨、1.25 g酵母浸膏、0.5 g葡萄糖、7.5 g瓊脂、500 mL蒸餾水、pH（7.0±0.2）。制作方法：將以上成分加于裝有500 mL蒸餾水的燒杯中，用萬能電爐煮沸溶解，精密酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH值。然后用錐形瓶分裝，121℃高壓滅菌15 min

1.3.7 活性肽蕎茶飲料的抗氧化性檢測(cè)

根據(jù)譚萍[21]、Thammarat Aree[22]等報(bào)道的DPPH自由基清除法，配制DPPH母溶液，準(zhǔn)確稱取0.044 g DPPH，用無水乙醇溶解并定容到100 mL容量瓶里，配制成120 μmol/LDPPH母液在0℃～4℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH工作液的配制是用量筒量取10 mL母液后用無水乙醇稀釋10倍即用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中。

對(duì)照組：取2 mL無水乙醇和4 mLDPPH工作液混合同一試管中，搖勻后放置在黑暗處避光30 min，以無水乙醇為空白對(duì)照，在波長為517 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i。

試驗(yàn)組：取2 mL活性肽蕎茶飲料成品和4 mL DPPH工作液加入同一試管中混合，搖勻后放置在黑暗處避光30 min，以無水乙醇為空白對(duì)照，在波長為517 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)j。所測(cè)得吸光度按照下列公式計(jì)算清除率：

式中：Ai為DPPH與溶劑混合后的吸光值；Aj為DPPH和樣液反應(yīng)后的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.1.1 苦蕎茶添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料口感的影響

苦蕎麥活性肽添加量1.5%、蜂蜜添加量4%，苦蕎茶添加量設(shè)計(jì)5個(gè)添加量梯度為3%、4%、5%、6%、7%。根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分見圖1。

圖1 苦蕎茶添加量的感官評(píng)分圖Fig.1 Sensory scoring of addition amount in tartary buckwheat tea

苦蕎茶添加量為5%時(shí)感官評(píng)分最高，即活性肽蕎茶飲料的顏色為亮黃色、氣味適中、口感好無苦澀、液體狀態(tài)均勻；苦蕎麥添加量少于5%時(shí)苦蕎茶的香味偏淡，當(dāng)添加量大于5%時(shí)有苦味和澀味。因此苦蕎茶的最適添加量選為5%。

2.1.2 蜂蜜的添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料口感的影響

苦蕎麥活性肽添加量1.5%、苦蕎麥添加量5%，蜂蜜添加量設(shè)計(jì)5個(gè)梯度為3%、4%、5%、6%、7%，根據(jù)感官評(píng)價(jià)綜合評(píng)分見圖2。

圖2 蜂蜜添加量的感官評(píng)分圖Fig.2 Sensory scoring of addition amount in honey

蜂蜜添加量為4%感官評(píng)分最高，當(dāng)蜂蜜添加量為3%時(shí)色澤及液體狀態(tài)均良好、口感明顯降低，即甜味過淡且苦蕎麥活性肽味沒有很好的掩蓋；當(dāng)蜂蜜添加量大于4%時(shí)口感偏甜，感官評(píng)分下降。當(dāng)蜂蜜添加量為4%時(shí)，活性肽蕎茶飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)最佳，因此蜂蜜的最適添加量為4%。

2.1.3 苦蕎麥活性肽添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料口感的影響

苦蕎茶添加量5%、蜂蜜添加量4%，苦蕎麥活性肽添加量設(shè)計(jì)5個(gè)添加量梯度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分見圖3。

圖3 苦蕎麥活性肽添加量的感官評(píng)分圖Fig.3 Sensory scoring of addition amount in buckwheat active peptide

苦蕎麥活性肽添加量不斷增加時(shí)，添加量為1.5%感官評(píng)分最高。苦蕎麥活性肽添加量過低飲料香氣、口感偏淡，苦蕎麥活性肽添加量過高則肽味明顯。當(dāng)苦蕎麥活性肽添加量為1.5%時(shí)感官評(píng)分最高，飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)最佳，因此苦蕎麥活性肽的最適添加量選為1.5%。

2.2 正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)是在單因素所得結(jié)果的基礎(chǔ)上完成，3個(gè)因素分別為苦蕎麥活性肽的添加量、苦蕎茶的添加量、蜂蜜的添加量，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，結(jié)果見表3。

從飲料配方L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果看出苦蕎麥活性肽添加量、苦蕎茶添加量、蜂蜜添加量對(duì)活性肽蕎茶飲料的影響從大到小為苦蕎麥活性肽添加量＞苦蕎茶添加量＞蜂蜜。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得A2B1C3配方是最佳，但實(shí)際上的出口味最佳的是第5組配方A2B2C3，分析結(jié)果與實(shí)際不符合，需要再驗(yàn)證。分別按照A2B1C3和A2B2C3配方調(diào)配飲料，試驗(yàn)結(jié)果表明A2B2C3配方在顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)上比A2B1C3配方感官評(píng)價(jià)高。因此可以得出活性肽蕎茶飲料最佳配方為A2B2C3，即苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、苦蕎茶添加量為5%、蜂蜜添加量為5%。

表3 飲料配方L9（33）正交試驗(yàn)表Table 3 L9（33）Orthogonal test table for beverage formulation

2.3 滅菌條件的篩選

苦蕎麥活性肽添加量1.5%、苦蕎茶添加量5%、蜂蜜添加量5%，滅菌條件設(shè)計(jì)5個(gè)梯度為75℃20 min、85℃20 min、95℃20 min、105℃20 min、115℃20 min，編號(hào)為1-5組，每組兩份。根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分及菌落檢測(cè)見表4。

表4 滅菌條件的感官評(píng)分圖Table 4 Sensory scoring tables for sterilization conditions

結(jié)果顯示，滅菌條件為75℃20 min時(shí)顏色淡黃色清亮、氣味、口感和液體狀態(tài)均良好，但微生物檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)菌落，視為不合格。當(dāng)滅菌條件高于75℃20 min時(shí)未檢測(cè)出菌落，但滅菌條件為115℃20 min時(shí)顏色深褐色且口感變苦且還有少許沉淀，可知高溫對(duì)飲料的口感及顏色有影響。與其他條件相比，滅菌條件為105℃20 min時(shí)活性肽蕎茶飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)最佳，因此滅菌條件選為105℃20 min。

2.4 活性肽蕎茶飲料微生物檢測(cè)結(jié)果與分析

活性肽蕎茶飲料經(jīng)105℃20 min滅菌后分別放置7、14、21、28 d，再進(jìn)行微生物檢測(cè)。通過觀察檢測(cè)出菌落，觀察結(jié)果見表5。

表5 飲料微生物檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果Table 5 Results of microbiological testing indicators for beverages

飲料滅菌室溫放置28 d后經(jīng)微生物檢測(cè)并沒有發(fā)現(xiàn)平板上出現(xiàn)菌落，可知飲料的滅菌條件為105℃20 min時(shí)不僅口感良好而且未檢測(cè)出菌落。初步判斷活性肽蕎茶飲料是安全且保質(zhì)期較長。如果活性肽蕎茶飲料得以上市，則需要用更精確的微生物檢測(cè)方法對(duì)飲料中微生物進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 活性肽蕎茶飲料的抗氧化性檢測(cè)結(jié)果與分析

通過正交試驗(yàn)結(jié)果調(diào)配的活性肽蕎茶飲料，滅菌后進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)。采用DPPH自由基清除法通過分光光度計(jì)測(cè)定工作液吸光度值為0.723，飲品DPPH樣液吸光度值為0.250。計(jì)算得出飲品DPPH自由基清除率達(dá)到65.42%。

3 結(jié)論與討論

通過單因素及正交試驗(yàn)可知苦蕎麥活性肽、苦蕎茶、蜂蜜對(duì)活性肽蕎茶飲料的影響從大到小為苦蕎麥活性肽添加量＞苦蕎茶添加量＞蜂蜜，將這三因素按比例混合后飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)得到很好的綜合，根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分后得活性肽蕎茶飲料的最佳配方，即苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、苦蕎茶添加量為5%、蜂蜜的添加量為5%，且滅菌條件為105℃20 min。

在食品安全方面，采用平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)飲料，初步檢測(cè)尚未出現(xiàn)菌落。若活性肽蕎茶飲料可以上市，對(duì)飲料微生物檢測(cè)的要求更嚴(yán)格，需將飲料送到食品微生物檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。

苦蕎麥活性肽有較強(qiáng)抗氧化功能，對(duì)飲料樣品進(jìn)行抗氧化性檢測(cè)時(shí)，利用分光光度計(jì)檢測(cè)出自由基清除率達(dá)65.42%，在功能性飲料中抗氧化性可以說是比較高的。因此可以將活性肽蕎茶飲料作為一種功能性飲料進(jìn)行開發(fā)。該功能性飲料現(xiàn)處于試驗(yàn)階段，若要作為產(chǎn)品推向市場(chǎng)，還需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)飲料進(jìn)行安全性及功能性的進(jìn)一步檢測(cè)。

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