譚萍，方玉梅，周斯弼

（六盤水師范學院，貴州六盤水553004）

苦蕎麥，蓼科雙子葉植物，俗稱苦蕎。一年生草本植物。我國大量種植苦蕎麥，現(xiàn)種植面積及產(chǎn)量居全球第一[1]。性味苦、平、寒是苦蕎麥的特征，且有益氣、提神、降氣、健胃、利耳明目等作用，生理功能有防治冠心病、降血糖、高血壓、抗菌、抗病毒、抗癌、防止內(nèi)出血、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等多種功能[2-4]。根據(jù)研究表明苦蕎麥中富含的活性肽與生理功能和藥用價值有一定的關聯(lián)。

近幾年來，活性肽已引起了世界各國家食品營養(yǎng)及醫(yī)學界的關注。如我國王竹清[5]等研究了生物活性肽及其研究進展；崔霞[6]等研究酶法水解苦蕎麥活性肽有7種人體必需氨基酸；崔霞[2]等研究了苦蕎麥活性肽的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢；安毅[7]等研究大豆蛋白活性肽在功能性食品中的應用及發(fā)展前景；張宇昊[8]等研究花生短肽降血壓活性；郭曉娜[9]等研究苦蕎麥蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究。綜上所述，活性肽具有降血壓、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功能。

由于活性肽具有多種生理功能，許多研究者將活性肽用于飲料研究。例如：李俠[10]等研制大豆-蕎麥多肽復合營養(yǎng)飲料；馬龍[11]等研究雞骨多肽保健飲品工藝；鞏婷婷[12]等研究大豆活性肽飲料；范鎮(zhèn)基[13]等研究玉米肽解酒飲料；馬平[14]等研究人參乳清蛋白多肽飲料的穩(wěn)定性及活性；譚斌[15]等研究橙汁花生肽飲料、鮑九枝[16]等研究大鯢肉活性肽飲料等。但對苦蕎麥活性肽飲料的研究很少，目前苦蕎麥加工制作的產(chǎn)品主要以苦蕎茶、蕎麥面包、蕎酥、苦蕎醋等初級加工產(chǎn)品為主，只有周小理[1]等研究苦蕎多肽營養(yǎng)飲料，但該飲料尚未形成產(chǎn)品上市。本研究以此為切入點深入研究活性肽蕎茶飲料，不僅滿足市場對苦蕎麥活性肽產(chǎn)品多樣化的需求，而且對蕎麥的深加工和開發(fā)我國蕎麥特色資源具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦蕎麥肽：六盤水師范學院生命科學系植物生理實驗室所制；蕎麥：六苦4號；蜂蜜：惠宜-蜂蜜-蘭溪市鴻香生物科技有限公司；胰蛋白胨：北京力高興業(yè)科技有限公司；酵母浸膏：濟南杰輝商貿(mào)有限公司；葡萄糖：新沂市英會工貿(mào)有限責任公司；瓊脂：河南中偌生物科技有限公司；DPPH：西安熱默爾生物科技有限公司；無水乙醇：蘇州市祿浩化工原料有限公司。

1.2 試驗儀器

三洋高壓滅菌鍋：SANYO；萬能電爐：深圳市寶安區(qū)新安晶藝電熱器設備商行；PHS-2C精密酸度計：上海虹益儀器表有限公司；FA2014電子天平：重慶市松朗電子儀器有限公司；TDZ5臺式低速離心機：蘇州業(yè)之峰離心機制造有限公司；722型可見分光光度計：上海馳唐儀器：實業(yè)有限公司；DHP-9270B恒溫培養(yǎng)箱：北京林茂科技有限公司；202A-3型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：東莞市華凱檢測設備科技有限公司；JJ-CJ-2F超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 活性肽蕎茶飲料工藝流程

1.3.2 活性肽蕎茶飲料感官評價

根據(jù)飲料感官評定標準[17]，設計活性肽蕎茶飲料感官評價表，由對飲料感官評價標準熟悉的10位實驗室人員（♂：5、♀：5）進行評分，滿分 100 分，感官評價標準見表1。

表1 活性肽蕎茶飲料感官評價標準Table 1 Active peptide buckwheat tea beverage sensory evaluation criteria

1.3.3 活性肽蕎茶飲料配方單因素試驗

影響活性肽蕎茶飲料的因素有苦蕎茶的添加量，苦蕎麥肽、蜂蜜的添加量，通過設計單因素試驗來確定影響活性肽蕎茶飲料的各個因素的添加量。

1.3.3.1 自制苦蕎茶

苦蕎米經(jīng)清洗、烘干、炒制后得到自制苦蕎茶。

1.3.3.2 苦蕎茶添加量對活性肽蕎茶飲料感官的影響

取苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、蜂蜜的添加量為4%，苦蕎茶添加量分別為3%、4%、5%、6%、7%，并取100 mL苦蕎茶與其混合均勻。根據(jù)感官評價標準確定苦蕎茶最佳添加量。

1.3.3.3 蜂蜜的添加量對活性肽蕎茶飲料感官的影響

苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、苦蕎茶的添加量為5%，蜂蜜添加量分別為3%、4%、5%、6%、7%，并取100 mL苦蕎茶與其混合均勻。根據(jù)感官評價標準確定蜂蜜最佳添加量。

1.3.3.4 苦蕎麥活性肽添加量對活性肽蕎茶飲料感官的影響

苦蕎茶添加量為5%、蜂蜜的添加量為4%，苦蕎茶活性肽添加量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，并取100 mL苦蕎茶與其混合均勻。根據(jù)感官評價標準確定苦蕎茶活性肽最佳添加量。

1.3.4 活性肽蕎茶飲料配方正交試驗

為了獲得活性肽蕎茶飲料的最佳配方，根據(jù)單因素試驗所確定的苦蕎活性肽、苦蕎茶、蜂蜜的最適添加量，對苦蕎活性肽、苦蕎茶、蜂蜜添加量進行L9（33）正交設計如表2，通過感官評價分析確定飲料中苦蕎活性肽、苦蕎茶、蜂蜜的添加量。

表2 L9（33）正交試驗設計因素水平表Table 2 L9（33）Level table of orthogonal experimental design factors

1.3.5 滅菌條件對活性肽蕎茶飲料感官的影響

王若敏[18]等報道活性肽較穩(wěn)定，在80℃～100℃條件下活性有最高值，為保證苦蕎麥活性肽的功能性，活性肽蕎茶飲料的滅菌條件設計為75℃20 min、85℃20 min、95 ℃ 20 min、105 ℃ 20 min、115 ℃ 20 min，根據(jù)感官評價標準確定最適的滅菌條件。

1.3.6 活性肽蕎茶飲料微生物檢測

按照GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》，微生物檢測標準：菌落總數(shù)≤100 CFU/mL。微生物檢測步驟[19-20]：配制平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基，無菌操作條件下，將15 mL～20 mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可以放在46℃左右的恒溫水浴保溫）倒入培養(yǎng)皿，用移液槍取經(jīng)過滅菌的活性肽蕎茶飲料1 mL注入培養(yǎng)基平板內(nèi)，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻。同時，分別吸取1mL無菌水加入培養(yǎng)基內(nèi)作空白對照。等待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（72±3）h觀察。觀察菌落時可用肉眼觀察，在必要的條件下可用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄相應的菌落數(shù)量。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基成分：2.5 g胰蛋白胨、1.25 g酵母浸膏、0.5 g葡萄糖、7.5 g瓊脂、500 mL蒸餾水、pH（7.0±0.2）。制作方法：將以上成分加于裝有500 mL蒸餾水的燒杯中，用萬能電爐煮沸溶解，精密酸度計調(diào)節(jié)pH值。然后用錐形瓶分裝，121℃高壓滅菌15 min

1.3.7 活性肽蕎茶飲料的抗氧化性檢測

根據(jù)譚萍[21]、Thammarat Aree[22]等報道的DPPH自由基清除法，配制DPPH母溶液，準確稱取0.044 g DPPH，用無水乙醇溶解并定容到100 mL容量瓶里，配制成120 μmol/LDPPH母液在0℃～4℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH工作液的配制是用量筒量取10 mL母液后用無水乙醇稀釋10倍即用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中。

對照組：取2 mL無水乙醇和4 mLDPPH工作液混合同一試管中，搖勻后放置在黑暗處避光30 min，以無水乙醇為空白對照，在波長為517 nm處測定其吸光度值Ai。

試驗組：取2 mL活性肽蕎茶飲料成品和4 mL DPPH工作液加入同一試管中混合，搖勻后放置在黑暗處避光30 min，以無水乙醇為空白對照，在波長為517 nm處測定其吸光度值Aj。所測得吸光度按照下列公式計算清除率：

式中：Ai為DPPH與溶劑混合后的吸光值；Aj為DPPH和樣液反應后的吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗的結果與分析

2.1.1 苦蕎茶添加量對活性肽蕎茶飲料口感的影響

苦蕎麥活性肽添加量1.5%、蜂蜜添加量4%，苦蕎茶添加量設計5個添加量梯度為3%、4%、5%、6%、7%。根據(jù)感官評價標準進行綜合評分見圖1。

圖1 苦蕎茶添加量的感官評分圖Fig.1 Sensory scoring of addition amount in tartary buckwheat tea

苦蕎茶添加量為5%時感官評分最高，即活性肽蕎茶飲料的顏色為亮黃色、氣味適中、口感好無苦澀、液體狀態(tài)均勻；苦蕎麥添加量少于5%時苦蕎茶的香味偏淡，當添加量大于5%時有苦味和澀味。因此苦蕎茶的最適添加量選為5%。

2.1.2 蜂蜜的添加量對活性肽蕎茶飲料口感的影響

苦蕎麥活性肽添加量1.5%、苦蕎麥添加量5%，蜂蜜添加量設計5個梯度為3%、4%、5%、6%、7%，根據(jù)感官評價綜合評分見圖2。

圖2 蜂蜜添加量的感官評分圖Fig.2 Sensory scoring of addition amount in honey

蜂蜜添加量為4%感官評分最高，當蜂蜜添加量為3%時色澤及液體狀態(tài)均良好、口感明顯降低，即甜味過淡且苦蕎麥活性肽味沒有很好的掩蓋；當蜂蜜添加量大于4%時口感偏甜，感官評分下降。當蜂蜜添加量為4%時，活性肽蕎茶飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)最佳，因此蜂蜜的最適添加量為4%。

2.1.3 苦蕎麥活性肽添加量對活性肽蕎茶飲料口感的影響

苦蕎茶添加量5%、蜂蜜添加量4%，苦蕎麥活性肽添加量設計5個添加量梯度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，根據(jù)感官評價標準進行綜合評分見圖3。

圖3 苦蕎麥活性肽添加量的感官評分圖Fig.3 Sensory scoring of addition amount in buckwheat active peptide

苦蕎麥活性肽添加量不斷增加時，添加量為1.5%感官評分最高?？嗍w麥活性肽添加量過低飲料香氣、口感偏淡，苦蕎麥活性肽添加量過高則肽味明顯。當苦蕎麥活性肽添加量為1.5%時感官評分最高，飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)最佳，因此苦蕎麥活性肽的最適添加量選為1.5%。

2.2 正交試驗的結果與分析

正交試驗的設計是在單因素所得結果的基礎上完成，3個因素分別為苦蕎麥活性肽的添加量、苦蕎茶的添加量、蜂蜜的添加量，進行L9（33）正交試驗，根據(jù)感官評價標準進行感官評分，結果見表3。

從飲料配方L9（33）正交試驗結果看出苦蕎麥活性肽添加量、苦蕎茶添加量、蜂蜜添加量對活性肽蕎茶飲料的影響從大到小為苦蕎麥活性肽添加量＞苦蕎茶添加量＞蜂蜜。正交試驗數(shù)據(jù)分析得A2B1C3配方是最佳，但實際上的出口味最佳的是第5組配方A2B2C3，分析結果與實際不符合，需要再驗證。分別按照A2B1C3和A2B2C3配方調(diào)配飲料，試驗結果表明A2B2C3配方在顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)上比A2B1C3配方感官評價高。因此可以得出活性肽蕎茶飲料最佳配方為A2B2C3，即苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、苦蕎茶添加量為5%、蜂蜜添加量為5%。

表3 飲料配方L9（33）正交試驗表Table 3 L9（33）Orthogonal test table for beverage formulation

2.3 滅菌條件的篩選

苦蕎麥活性肽添加量1.5%、苦蕎茶添加量5%、蜂蜜添加量5%，滅菌條件設計5個梯度為75℃20 min、85℃20 min、95℃20 min、105℃20 min、115℃20 min，編號為1-5組，每組兩份。根據(jù)感官評價標準進行綜合評分及菌落檢測見表4。

表4 滅菌條件的感官評分圖Table 4 Sensory scoring tables for sterilization conditions

結果顯示，滅菌條件為75℃20 min時顏色淡黃色清亮、氣味、口感和液體狀態(tài)均良好，但微生物檢測時出現(xiàn)菌落，視為不合格。當滅菌條件高于75℃20 min時未檢測出菌落，但滅菌條件為115℃20 min時顏色深褐色且口感變苦且還有少許沉淀，可知高溫對飲料的口感及顏色有影響。與其他條件相比，滅菌條件為105℃20 min時活性肽蕎茶飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)最佳，因此滅菌條件選為105℃20 min。

2.4 活性肽蕎茶飲料微生物檢測結果與分析

活性肽蕎茶飲料經(jīng)105℃20 min滅菌后分別放置7、14、21、28 d，再進行微生物檢測。通過觀察檢測出菌落，觀察結果見表5。

表5 飲料微生物檢測指標結果Table 5 Results of microbiological testing indicators for beverages

飲料滅菌室溫放置28 d后經(jīng)微生物檢測并沒有發(fā)現(xiàn)平板上出現(xiàn)菌落，可知飲料的滅菌條件為105℃20 min時不僅口感良好而且未檢測出菌落。初步判斷活性肽蕎茶飲料是安全且保質(zhì)期較長。如果活性肽蕎茶飲料得以上市，則需要用更精確的微生物檢測方法對飲料中微生物進行檢測。

2.5 活性肽蕎茶飲料的抗氧化性檢測結果與分析

通過正交試驗結果調(diào)配的活性肽蕎茶飲料，滅菌后進行抗氧化活性檢測。采用DPPH自由基清除法通過分光光度計測定工作液吸光度值為0.723，飲品DPPH樣液吸光度值為0.250。計算得出飲品DPPH自由基清除率達到65.42%。

3 結論與討論

通過單因素及正交試驗可知苦蕎麥活性肽、苦蕎茶、蜂蜜對活性肽蕎茶飲料的影響從大到小為苦蕎麥活性肽添加量＞苦蕎茶添加量＞蜂蜜，將這三因素按比例混合后飲料的顏色、氣味、口感、液體狀態(tài)得到很好的綜合，根據(jù)感官評價標準進行評分后得活性肽蕎茶飲料的最佳配方，即苦蕎麥活性肽添加量為1.5%、苦蕎茶添加量為5%、蜂蜜的添加量為5%，且滅菌條件為105℃20 min。

在食品安全方面，采用平板計數(shù)方法檢測飲料，初步檢測尚未出現(xiàn)菌落。若活性肽蕎茶飲料可以上市，對飲料微生物檢測的要求更嚴格，需將飲料送到食品微生物檢測機構進行檢測。

苦蕎麥活性肽有較強抗氧化功能，對飲料樣品進行抗氧化性檢測時，利用分光光度計檢測出自由基清除率達65.42%，在功能性飲料中抗氧化性可以說是比較高的。因此可以將活性肽蕎茶飲料作為一種功能性飲料進行開發(fā)。該功能性飲料現(xiàn)處于試驗階段，若要作為產(chǎn)品推向市場，還需要進行動物實驗，對飲料進行安全性及功能性的進一步檢測。

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