邱嵐，梁琍，邱學云，付素靜

（銅仁學院農林工程與規(guī)劃學院，貴州省梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州銅仁554300）

蘆丁（Rutin），又名蕓香苷（5，7，3c，4c，-四羥基-3-蕓香糖黃酮），為黃酮類化合物廣泛存在于多種藥材和食材中，豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾即槐米（flossophorae）中尤為豐富，且具有較高的利用價值，在藥用方面，用于預防和治療糖尿病及合并高血脂癥，同時還有抗炎、抗病毒等作用[1]。蘆丁可改變細菌的細胞內、外膜的滲透性而使細胞膜受到破壞[2]，因此有抑菌、抗氧化的等作用。另外，在食品、化妝品登方面應用也很廣泛。國外也常用蘆丁做食品及飲料的染色劑[3]，除此之外，可用作抗氧劑及天然食用黃色素。另外，蘆丁對紫外線有較強的吸收作用，能吸收A區(qū)（波長320 nm～400 nm）紫外線，所以蘆丁可單用或與黃芩苷[能吸收B區(qū)（波長280～320 nm）紫外線]合用，作防曬霜的主要成分[4]。因此，在化妝品行業(yè)具有廣闊的應用前景。

目前，人們對槐米中蘆丁的提取方法已有部分研究，如舒曉宏等[5]對槐花米中蘆丁提取最佳pH值的實驗研究。張來新[6]主要對槐花米中提取蘆丁的幾種方法比較。如“水提法”，“堿水（石灰水）提取法”，“有機溶劑（乙醇）回流法”。除此之外，對槐米中蘆丁的提取方法還有采用堿提酸沉法[7]，滲漉法[8]，微波輔助提取法[9]、“超聲波法[10]”進行提取。但各種方法均各有不足，即存在浪費材料、條件難控制、提取率低，或是僅在單因素上進行研究，沒有對超聲提取條件進行優(yōu)化，或未考慮蘆丁分子因含有鄰二酚羥基而在堿性條件下更易氧化分解對提取率產生影響等問題。廖華衛(wèi)等[11]雖然利用正交法對槐米中蘆丁的提取進行優(yōu)化，可是仍用煎煮的方法提取，也存在成本高，得率低的缺點。因此為了縮短提取時間、降低成本、提高產率，本試驗采用超聲輔助提取綜合堿溶酸沉的原理提取槐米中的蘆丁，通過響應面試驗優(yōu)選出最佳的提取工藝。響應面法最早出現在1951年，由英國的兩位學者Box和Wilson提出。是利用統(tǒng)計軟件進行合理的實驗設計[12]，采用多元二次回歸方程將多因素試驗中的各因素與指標的相互關系進行擬合，通過對試驗建立數學模型然后進行分析研究因素與響應面之間、因素與因素之間的相互關系，從而來優(yōu)化工藝參數的統(tǒng)計分析方法。其優(yōu)點在于試驗次數少，試驗精度高[13]，且適合于多因素、多水平的試驗，彌補了正交優(yōu)化法只能考慮單一因素對提取率的影響，并且得到國內外科研學者的廣泛利用。

銅仁學院校園內乃至整個銅仁地區(qū)每到春天都開滿了槐花，彌漫著槐花的香味，而目前為止它們大多都被當作行道樹，僅僅體現其園林應用價值，對槐米中蘆丁的提取工藝及蘆丁藥用和在化妝品行業(yè)中利用價值的開發(fā)研究卻還比較少。本項目對銅仁學院槐米中蘆丁提取工藝進行探索研究，為今后進一步合理開發(fā)槐米資源提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

槐米采自銅仁市銅仁學院老校區(qū)，干燥后室溫密封保存。

1.1.2 試劑

無水甲醇：天津市富宇金細化工有限公司；亞硝酸鈉溶液：天津市博迪化工有限公司；硝酸鋁溶液：天津市密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉溶液：天津市石英終廠霸州分廠；鹽酸溶液：衡陽市凱信試劑有限公司；硼砂：天津市巴斯天化工有限公司；亞硫酸氫鈉：天津市博迪化工有限公司；蘆丁標準品：北京化學試劑公司；蒸餾水。

1.1.3 儀器

FW80高速萬能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司；101-3型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；GUTEL超聲波清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司；W201B恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司；TDL-5臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；KQ-C玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市予華有限責任公司；PL602-5電子分析天平：奧豪斯儀器上海有限公司；SHZ-DIII予華牌循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

將采摘后的槐花蕾除去雜質、枝條、梗，即刻于110℃烤箱內殺青再調溫到60℃烘干至恒重，經萬能粉碎機粉碎獲得槐米粉末，粉末于室溫下密封保存。

1.2.2 超聲波輔助提取槐米蘆丁及得率測定

采集槐米樣品→干燥→粉碎→按一定的料液比加溶劑（并加入硼砂、亞硫酸氫鈉）→調pH值（8～9）→超聲波輔助提取→過濾→濾液鹽酸調pH值（2～3）→靜置→抽濾→干燥→蘆丁粗提物。

稱取蘆丁粗品→加甲醇溶解并定容→量取經稀釋后的樣品液→加入5%亞硝酸鈉溶液→10%硝酸鋁溶液→4.3%氫氧化鈉→加蒸餾水定容至25 mL→揺均放置→500 nm波長下吸測定光值[14]。

1.2.3 標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標準品2 mg，置于10 mL容量瓶中，加入一定量甲醇，水浴微熱溶解后，放冷，繼續(xù)加甲醇溶液至刻度，搖勻。精密吸取2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻即得蘆丁標準液（含量為0.2 mg/mL）。分別精密量取上述標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL與6.0 mL置于6個25 mL容量瓶中，并加水至6mL，之后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL搖勻（放置6 min），再加入10%硝酸鋁溶液1 mL搖勻（放置6 min），然后加入4.0%NaOH溶液10 mL，最后加水至刻度，搖勻，靜置15 min，于紫外分光光度儀中，在500 nm的波長[15]下測定蘆丁標準品的吸光值，并以標準溶液的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，制得作標準曲線圖（見圖1）依圖得到的趨勢線回歸方程為：Y=16.429x+0.021 6，R2=0.998（n=6）。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.4 樣品蘆丁含量的測定

蘆丁提取率計算公式為：

式中：A為提取蘆丁溶液的吸光度；M為槐米干粉，g；M1為稱取的干燥蘆丁粗品，g；M2為提取的總干燥蘆丁粗品，g。

1.2.5 單因素試驗

選取料液比、超聲波時間、超聲次數為單因素，分別依次按照1.2.2進行槐米中蘆丁提取的單因素試驗。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素的試驗基礎之上，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，利用Design-Expert.V8.0進行三因素三水平響應面分析法[16]。以100 W的超聲波固定功率，選取料液比（A）、超聲波時間（B）、超聲波次數（C）為自變量，蘆丁提取率（Y）為響應值。進行優(yōu)化超聲波提取蘆丁的工藝條件[14]。各因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 The response surface test factors level tables

1.2.7 數據的處理與分析

標注曲線制作及單因素試驗數據是采用Origin pro7.5處理。響應面優(yōu)化試驗數據采用Design-Expert.V 8.0進行分析處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對蘆丁提取率的影響

準確稱取5.00 g槐米粉末5份，分別放入錐形瓶中按 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）的料液比加入蒸餾水，在室溫下放入超聲波裝置中，室溫下超聲時間20 min，超聲固定功率100 W，超聲提取2次，最后得到最佳的料液比，平行試驗3次，求平均值。試驗結果見圖2。

圖2 料液比對蘆丁提取率的影響Fig.2 Effects of liquid ratio on rutin yield

由圖 2 看出，料液比在 1 ∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）之間，料液比增加，蘆丁提取率也隨著增加，在1∶15（g/mL）時達到最大值，在此之后料液比逐漸增大蘆丁提取率出現下降趨勢，其原因為在蘆丁提取全過程中，原料及成品總會有損失，料液比越大，損失越嚴重，而在1∶15（g/mL）時提取蘆丁的量達到最大，故在 1 ∶15（g/mL）是蘆丁提取最適合的料液比，提取率達到最大值。

2.1.2 超聲提取時間對蘆丁提取率的影響

準確稱取5.00 g槐米粉末5份，分別放入錐形瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入蒸餾水于室溫下放入超聲波，超聲時間為 5、10、20、30、40 min，超聲波固定功率為100 W，超聲提取2次，最后得到最佳的超聲提取時間，平行試驗3次，求平均值。試驗結果見圖3。

圖3 提取時間對蘆丁提取率的影響Fig.3 Effect of time on rutin yield

由圖3看來，在20 min之前，蘆丁提取率隨時間增長而增加，其原因是超聲輻射時間過短，未能很好地使原料細胞壁被破壞，依此推理，若超聲輻射時間越長，蘆丁提取率將會不斷提高，而從圖中可知在20 min時蘆丁提取率最大，之后蘆丁提取率呈下降趨勢，這是由于原材料在超聲輻射下時間越長，空化作用越明顯即是會形成越細的顆粒，在過濾的環(huán)節(jié)中則造成更多損失，從而造成蘆丁提取率下降[17]。

2.1.3 超聲提取次數對蘆丁提取率的影響

準確稱取5.00 g槐米粉末5份，分別放入錐形瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入蒸餾水于室溫下放入超聲波，超聲時間為20 min，超聲波固定功率為100 W，超聲次數分別是1次、2次、3次、4次、5次，最后得到最佳的超聲提取次數，平行試驗3次，求平均值。試驗結果見圖4。

圖4 提取次數對蘆丁提取率的影響Fig.4 Effect of number of extraction times on rutin yield

從圖4可知，超聲波輻射1次蘆丁提取率明顯較低，輻射2次提取率達最大值，隨后超聲輻射次數增多蘆丁提取率卻未增加，其原因有提取次數增多提取液漸漸黏稠過濾困難造成材料的大量損失，另外，當超聲輻射次數增多，按理說提取率應該不斷增大然后不變，實際上隨提取次數的增多，蘆丁會被氧化的量就會增大，從而造成蘆丁提取率降低[18]。

2.2 響應面法優(yōu)化槐米中蘆丁超聲提取工藝

2.2.1 響應面優(yōu)化試驗設計及結果

為了優(yōu)化超聲提取蘆丁的最佳工藝條件。以料液比（A）、超聲提取時間（B）、超聲提取次數（C）為自變量，以蘆丁提取率（Y）為響應值，進行三因素三水平響應面分析試驗[19-20]，試驗設計方案及結果見表2。共17個試驗。1～12為析因試驗，13～17為中心試驗，用以估計試驗誤差，方差分析見表3?；貧w模型可靠性分析見表4。

表2 響應面試驗設計及試驗結果Table 2 The results and experimental designs of the response surface

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation

表4 回歸模型可靠性分析Table 4 Credibility analysis of the regression model

利用響應面分析法優(yōu)化超聲輔助提取槐米中蘆丁的工藝參數，并采用Design Expert V 8.0軟件進行分析，結果見表2，對表2結果進行統(tǒng)計分析，可建立如下多元二次回歸方程：Y=17.97+0.74A+0.36B+0.41C-0.073AB+0.14AC-0.69BC-1.79A2-1.32B2-1.23C2，對二次回歸方程進行方差及可靠性分析，結果見表3、表4，從表3可知，該二次回歸方程的一次項、二次項及交互項中的 A、B、C、A2、B2、C2、BC 均表現出了顯著水平，該二次回歸方程整體模型比較顯著，并且失擬項不顯著，該回歸模型與實測值能較好地擬合。

2.2.2 響應面分析

為了考察交互項對提取率的影響，在其他因素條件不變的情況下，考察交互項對提取率的影響，對模型進行降維分析，經Design-Expert V 8.0軟件分析所得的響應面圖見圖5。

圖5 料液比、超聲時間、超聲次數對蘆丁提取率交互影響響應面圖Fig.5 Response surface plot showing the effects of interaction between solid-liquid ratio，ultrasonic time and ultrasonic times on the yieid of rutin

由圖5可知，隨著每個因素的增大，響應值增大，當響應值增大到極限值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減??；在交互項BC交互作用明顯，與方差分析結果一致。影響超聲提取槐米蘆丁的主次因素為A>C>B，即料液比>超聲提取次數>超聲提取時間。

2.2.3 最佳工藝的確定

通過Design-Expert V 8.0 RSM計算出最佳提取工藝條件和蘆丁提取率最大值，最佳提取條件為料液比1 ∶16.06（g/mL）、超聲提取時間 20.90 min、超聲提取次數2.16次，理論提取率為18.09%。并根據實驗室條件將最佳提取工藝條件進行修正[21]，修正后的提取條件為料液比 1 ∶16.00（g/mL）、超聲提取時間 20.00 min、超聲提取次數2.00次。在修正后的條件下，重復試驗5次測蘆丁的提取率，并計算RSD試驗條件與結果見表5。

表5 驗證試驗結果Table 5 Verification testing results

由表5可知，根據實驗室條件在最佳提取工藝條件下重復試驗，蘆丁提取率為17.96%，接近理論提取率18.09%，RSD為1.15%，說明響應面法建立的槐米中蘆丁的提取數學模型具有穩(wěn)定可靠性，試驗結果與模型符合良好。

3 結論與討論

在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert V 8.0軟件中的Box-Behnken（BBD）中心組合原理設計響應面試驗以及響應面分析法，建立了以料液比（A）、超聲提取時間（B）、超聲提取次數（C）為自變量，槐米蘆丁提取率為響應值（Y）的多元二次回歸數學模型、方差和可信度分析，回歸決定系數達0.969 3，回歸模型極顯著，無失擬項，根據優(yōu)化條件進行驗證試驗，取料液比1 ∶16（g/mL）、超聲提取時間 20 min、超聲提取次數2次，提取率為17.96%與預測值相差較小，RSD為1.15%，說明響應面法建立的槐米中蘆丁提取率數學模型對槐米中蘆丁提取具有穩(wěn)定可靠性，因此該提取條件合理可行。本次研究采用超聲波提取槐米中蘆丁，提取原理則是基于超聲波的空化作用和蘆丁的堿溶酸沉，即是將二者相結合，利用響應面法來優(yōu)化提取槐米中蘆丁的最佳工藝。與正交設計比較，正設計法只能從預先設計的幾個水平中優(yōu)化組合，所得的最佳工藝條件只是理想條件，不是真實意義的最佳條件。因此，采用RSM法優(yōu)化得到的提取條件可靠準確，具有實用價值。與傳統(tǒng)的“水提法”、“堿提法”、“微波輔助提取法”等方法相比，超聲輔助提取法提取率高，其原因可能是，以上幾種提取方法未能很好地使植物細胞內的蘆丁最大限度溶于提取溶劑中，而超聲波具有空化作用，因此超聲輔助提取法即在蘆丁溶于提取溶劑中占優(yōu)勢。與馬國剛[18]、薩燕平[22]、郭乃妮[23]等的超聲輔助提取的研究相比，本研究使用的超聲清洗器頻率和功率與之不同，且對蘆丁提取的影響因素選擇，提取溶劑，堿提或酸沉過程中pH值的大小（堿提為8～9，酸沉為2～3較好），原料粒度，原料產地及采取時間都有差異。

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