李西騰，張佳佳，尹嵐，鄭楠

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，江蘇淮安223003）

白茅根為禾本科多年生草本植物白茅的根莖[1]，白茅根中含有三萜類(lèi)化合物、苯丙素類(lèi)化合物、有機(jī)酸類(lèi)化合物、糖類(lèi)、甾醇類(lèi)、色原酮、黃酮類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)，以及鐵、銅、鋅等礦物質(zhì)，主要有止血、免疫調(diào)節(jié)、利尿降壓、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低羥自由基、抗氧化、改善腎功能等作用[2-7]。其中黃酮類(lèi)化合物具有清除人體內(nèi)自由基、改善血液循環(huán)、降低膽固醇等功效[8-10]。優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝，對(duì)其藥用開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義。目前，關(guān)于白茅根活性成分提取工藝的研究主要集中在多糖[11-13]、綠原酸[14-15]、總酚酸[16-18]、三萜類(lèi)化合物等成分[18]，尚無(wú)利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取白茅根總黃酮的工藝條件的研究報(bào)道。本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率、提取時(shí)間等因素進(jìn)行白茅根總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)，以響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茅根：淮安市藥材市場(chǎng)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YB-2500A型高速多功能粉碎機(jī)：浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司；SCIEENT型超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：日本島津公司；SHZ-DCⅢ循環(huán)水式真空泵：上海亞榮生化儀器廠；TU-1950紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白茅根總黃酮提取

將白茅根于60℃烘干后粉碎過(guò)60目篩。稱(chēng)取樣品1.0 g，加入乙醇溶液，置于超聲波清洗機(jī)中提取，抽濾，濾液稀釋后搖勻，作為待測(cè)液。

1.2.2 白茅根總黃酮測(cè)定方法

采取硝酸鋁顯色法[19-20]測(cè)定總黃酮含量。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

y=7.744 6x+0.005 6，R2=0.999 2。根據(jù)回歸方程，計(jì)算被測(cè)樣液中總黃酮的含量。

式中：c為樣品的吸光度代入回歸方程計(jì)算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液定容量，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以白茅根總黃酮提取量為指標(biāo)，對(duì)影響白茅根總黃酮提取的各單因素進(jìn)行研究。

乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定反應(yīng)條件液料比25∶1（mL/g），超聲功率400 W，超聲處理30 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響。

液料比：固定反應(yīng)條件乙醇50%，超聲功率400W，超聲處理30 min，考察不同液料比對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響。

超聲功率：固定反應(yīng)條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲處理30 min，考察不同超聲功率對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響。

時(shí)間：固定反應(yīng)條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲功率400 W，考察不同處理時(shí)間對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率和時(shí)間4個(gè)因素，黃酮提取量為響應(yīng)值，通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化最佳提取工藝條件，具體設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大時(shí)，白茅根總黃酮提取量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取到的總黃酮量較大，因此這里選擇50%的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2 液料比對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響

不同液料比對(duì)白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖2可知，當(dāng)液料比逐漸增加時(shí)，提取到的白茅根總黃酮的量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，液料比25∶1（mL/g）時(shí)最多。由于增加液料比會(huì)稀釋溶液，使得黏度得以降低，這對(duì)超聲波的空化非常有利，因此能夠增加提取量，然而，若料液比進(jìn)一步增加，溶液體積增加將會(huì)導(dǎo)致機(jī)械效應(yīng)以及空化作用減弱。所以，這里選擇液料比 25 ∶1（mL/g）。

2.1.3 超聲功率對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響

不同超聲功率對(duì)白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖3可知，當(dāng)超聲功率逐漸升高時(shí)，提取到的白茅根總黃酮的量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為500 W時(shí)，提取到的總黃酮的量較大，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮的提取量下降。因此，選擇超聲功率為500 W。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響

不同提取時(shí)間對(duì)白茅根總黃酮提取量影響的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)白茅根總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖4可知，總黃酮的提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增加，超過(guò)30 min降低。因此，選擇30 min為適宜的超聲時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到白茅根中總黃酮提取量（Y）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和提取時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=2.18-0.012A-0.056B+0.10C-0.058D-0.056AB-0.11AC+0.022AD-0.068BC-0.024BD-0.029CD-0.13A2-0.20B2-0.23C2-0.15D2。

2.2.2 回歸方程方差分析

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出模型Prob>F值小于0.000 1，表明該回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.982 3，說(shuō)明模型方程擬合程度好，可以用于黃酮提取試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficients and their significance test

2.2.3 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化

響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)白茅根總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

除了乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比、超聲功率和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響顯著。兩兩因素之間對(duì)響應(yīng)值均有一定的交互作用，其中AB、AC、BC之間的交互作用比較明顯。由圖5可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ投寄苓_(dá)到極值點(diǎn)，利用軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白茅根總黃酮的最佳提取工藝如下：乙醇體積分?jǐn)?shù) 48.50%、液料比 24.22∶1（mL/g）、超聲功率529.47 W、提取時(shí)間28.93 min，此時(shí)的預(yù)測(cè)值為2.21 mg/g。為方便實(shí)際操作，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比 25∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時(shí)間30 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果為2.18 mg/g，將試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明該回歸模型與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié)論

通過(guò)Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化并得到了提取白茅根總黃酮的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比 25 ∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時(shí)間 30 min，實(shí)際提取到的白茅根總黃酮為2.18 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值2.21 mg/g相近。說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝具有可行性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲輔助可以提高總黃酮的提取效率，還需要進(jìn)一步探討超聲對(duì)其生物活性影響的相關(guān)性，以及白茅根總黃酮的抗氧化活性。

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