秦文文，劉宇，李妹妹，郝寶成，王學(xué)紅，尚若鋒，黃鑫，衣云鵬，梁劍平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

茶樹（Teatree），又叫互葉白千層（Melaleucaalternifolia），桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melaleuca）植物，是一種短期栽種培育就可投入利用的經(jīng)濟(jì)林木[1-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，茶樹中含有多種黃酮類化合物，黃酮類化合物中有藥用價(jià)值的化合物很多，如向天果、槐米中的蘆丁和陳皮中的陳皮苷，它們具有多種生物活性和藥理作用[4]。在醫(yī)藥方面，黃酮類化合物具有心血管系統(tǒng)活性，如蘆丁、槲皮素、葛根素等具有明顯的擴(kuò)冠作用并且對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用；黃酮類化合物具有抗菌及抗病毒活性，如木犀草素、黃岑素等具有抗菌作用，槲皮素等具有抗病毒作用，從菊花中分離得到的黃酮單體及雞豆黃素A對(duì)人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）均有一定的抑制作用；此外，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物還具有抗炎抗腫瘤及抗氧化自由基等方面的生物活性[5]。在食品工業(yè)方面，主要將黃酮類化合物作為功能因子開發(fā)一些保健食品，用于提高機(jī)體的免疫力。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶樹的開發(fā)利用基本上以其精油為主，對(duì)其黃酮類化合物的化學(xué)成分及藥理作用的研究和開發(fā)相對(duì)較少。在實(shí)際生產(chǎn)中，提取完精油的茶樹枝葉通常作為廢料處理[6]。本試驗(yàn)以廣東茶樹枝葉為原料，以茶樹總黃酮得率為響應(yīng)值，利用超聲波輔助提取茶樹總黃酮[7-12]，并采用Box-Behnken對(duì)超聲波超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。通過對(duì)茶樹總黃酮的提取工藝的研究，旨在為茶樹中黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，以便實(shí)現(xiàn)茶樹資源的綜合利用。

1 材料、試劑與儀器

KH3200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204電子秤：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA MVP 10 basic真空泵：蘭州同正生物技術(shù)有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司；沃特浦制水機(jī)：四川沃特爾水處理有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純；茶樹枝葉：廣東富陽(yáng)。

2 方法

2.1 茶樹枝葉的預(yù)處理

稱取完全陰干的茶樹枝葉5 g，加入60%的乙醇125 mL，50℃水浴浸泡1 h，超聲提取40 min，抽濾提取液；重復(fù)操作3次，至樣品中的色素基本萃取干凈。將提取液于55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡乙醇，備用。

2.2 茶樹總黃酮的含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總黃酮含量測(cè)定方法為經(jīng)典亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法。本試驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定茶樹總黃酮的含量。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品11.0 mg，置于100 mL容量瓶中定容，然后分別取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，依次加入60%的乙醇至5 mL，10%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入8%的氫氧化鈉溶液2 mL，最后用60%的乙醇定容至10 mL，搖勻靜置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

2.2.2 樣品含量的測(cè)定

按照2.1項(xiàng)下的方法超聲提取，將所得提取液用60%的乙醇定容至25 mL，再吸取1 mL的提取液置于25 mL容量瓶中，然后按照2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以60%的乙醇溶液為提取劑，選擇影響茶樹總黃酮得率的4個(gè)因素乙醇溶液濃度、料液比、超聲時(shí)間及超聲溫度設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single factor test design

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)曲面的優(yōu)化范圍，確定超聲溫度為70℃。應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件，以X1乙醇濃度，X2料液比，X3超聲時(shí)間為變量，以-1，0，1代表變量低、中、高3個(gè)水平，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案見表2。

表2 因素水平及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trial

3 結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，得到回歸方程：A=12.391C-0.005 9（r=0.999 5）。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.011 mg/mL～0.055 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Rutin standard curve

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對(duì)茶樹總黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)茶樹總黃酮得率的影響結(jié)果如圖2。

由圖2可以看出總黃酮得率隨著乙醇濃度的增加先升高后降低，乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到最高值26.1 mg/g，當(dāng)乙醇濃度再增大時(shí)，總黃酮得率逐漸下降。開始可能是由于乙醇濃度增大，增大了溶質(zhì)與樣品的接觸，得率增加；隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，溶劑和溶質(zhì)的相對(duì)極性發(fā)生了改變，許多非生物堿類的其他物質(zhì)也被提取出來，從而影響了總黃酮的得率使其下降。試驗(yàn)表明乙醇濃度不宜過高，所以我們選取60%為乙醇濃度較為合適。

圖2 乙醇濃度對(duì)茶樹總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield

3.2.2 料液比對(duì)茶樹總黃酮得率的影響

料液比對(duì)茶樹總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)茶樹總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield

由圖3可以看出料液比在1∶30（g/mL）時(shí)總黃酮的得率最大。料液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）范圍內(nèi)，總黃酮的得率增幅較為明顯，在1∶25（g/mL）～1∶35（g/mL）時(shí)得率增幅減小趨于平穩(wěn)。說明在一定濃度范圍內(nèi)，增大助溶劑的量對(duì)總黃酮的提取有利，當(dāng)總黃酮的溶出達(dá)到平衡后再增大助溶劑的量對(duì)總黃酮的提取影響不大，所以我們選取料液比為1∶30（g/mL）最為合適。

3.2.3 提取時(shí)間對(duì)茶樹總黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)茶樹總黃酮得率的影響見圖4。

由圖4可以看出超聲時(shí)間為40 min時(shí)總黃酮的得率最大。超聲時(shí)間在10 min～40 min范圍內(nèi)總黃酮得率增幅較大，但在40 min～60 min時(shí)總黃酮得率趨于平穩(wěn)。說明提取時(shí)間對(duì)總黃酮的提取有顯著影響，時(shí)間過短不利于總黃酮的溶解，時(shí)間過長(zhǎng)可能引起總黃酮結(jié)構(gòu)的破壞得率下降，綜合考慮，提取時(shí)間為40 min較為適合。

圖4 提取時(shí)間對(duì)茶樹總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield

3.2.4 提取溫度對(duì)茶樹總黃酮得率的影響

提取溫度對(duì)茶樹總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)茶樹總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield

由圖5可以看出茶樹總黃酮得率隨提取溫度的升高變化不大，較為平穩(wěn)，說明提取溫度并非是影響茶樹總黃酮得率的主要因素。總黃酮得率在70℃時(shí)最大，所以選取70℃為提取溫度。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化茶樹總黃酮的提取工藝

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度（X1）、料液比（X2）及超聲時(shí)間（X3）3個(gè)主要考察變量，以茶樹總黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，研究其對(duì)茶樹總黃酮得率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface design and test results

續(xù)表3 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Response surface design and test results

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance results

由表3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為40 min時(shí)，茶樹總黃酮的得率最高為29.7 mg/g。應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到茶樹總黃酮得率（Y）對(duì)各因素變量的二次方程模型為：Y=29.29+0.68X1+1.91X2+0.81X3+1.25X1X2-1.39X1X3-0.47X2X3-3.02X12-1.97X22-2.93X32。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，由表4可知，P＜0.005，說明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著性；失擬項(xiàng)F=9.00＞8.81，失擬項(xiàng)P＜0.001，失擬顯著。模型的決定系數(shù)Adj R2=0.818 3，模型能解釋81.83%的響應(yīng)值變化，模型確定系數(shù)R2=0.920 5，模型擬合度良好，說明用此模型對(duì)超聲波提取茶樹總黃酮的效果進(jìn)行分析是合理可行的。

3.3.2 響應(yīng)曲面分析

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制響應(yīng)面，通過分析響應(yīng)面的形狀來考察3個(gè)主要因素對(duì)茶樹總黃酮得率的影響，響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 兩因素交互作用對(duì)茶樹總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing the effects of two factors interaction on the extraction rate of total flavonoids from tea tree

通過響應(yīng)面圖6，我們可以直觀的看出兩因素交互作用對(duì)茶樹總黃酮得率的影響，其中乙醇濃度和料液比的交互作用較為顯著。通過響應(yīng)面模型求最優(yōu)組合，得到茶樹總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度60%，料液比 1∶30（g/mL），提取時(shí)間 40 min，總黃酮的得率為29.7 mg/g。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取茶樹枝葉5 g，按優(yōu)化后的條件[乙醇濃度60%，料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間40 min]進(jìn)行茶樹總黃酮的提取驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。茶樹總黃酮得率的平均值為29.7 mg/g，RSD值為0.07%。說明，最佳提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有較好的穩(wěn)定性。

4 討論與結(jié)論

本文應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件，通過響應(yīng)面模型，得出茶樹總黃酮的最佳提取工藝條件及其兩因素之間的交互作用對(duì)茶樹總黃酮得率的影響。最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度60%，料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間40 min，乙醇濃度和料液比交互作用最為顯著，茶樹總黃酮的平均得率為（29.7±0.07）mg/g，說明該模型較為穩(wěn)定可靠。

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