康永鋒，薛永剛，韓巧英

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海201306；4.正寧縣人民醫(yī)院，甘肅慶陽745300）

豌豆（Pisum sativum Linn）又稱青豆、麥豌豆等，在我國種植范圍很廣，在日常飲食中也常食用或作為藥用。豌豆的蛋白質(zhì)含量高，還有人體所必需的氨基酸及其他礦物質(zhì)和維生素等[1]，營養(yǎng)成分豐富。豌豆性味甘平，有和中下氣、利小便、解瘡毒的功效[2]。目前國內(nèi)對豌豆的種植、加工研究的比較多，但是對豌豆的營養(yǎng)成分特別是帶有生物活性的黃酮類成分提取及生物活性研究的較少。黃酮類化合物是自然界中廣泛存在的一類重要的天然有機化合物。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、預防心血管疾病等很多生物活性[3-8]，在功能食品及醫(yī)藥領域廣受關注。大豆異黃酮是生物黃酮的一種，是豆科植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。自然界中異黃酮資源非常有限，其中豆科植物莢豆類、葛根等少數(shù)植物含異黃酮較多，其中以大豆含量最為豐富。一般每100 g大豆含有大豆異黃酮約14 mg～150 mg[9]，而且大豆也是唯一被認可具有營養(yǎng)學價值的異黃酮食物資源。黃酮類化合物也常作為藥效學指標進行定性與定量分析[10]，其中分光光度法測定總黃酮含量是目前最常用的測定方法[11-12]。

超聲波強烈的振動、空化效應和攪拌等作用可加速成分的溶出。超聲波輔助提取工藝有效提高提取率，縮短提取時間。超聲波輔助提取操作簡單方便、節(jié)省溶劑，近年來已廣泛應用于天然植物有效成分的提取[13-15]。本研究采用專門的超聲波提取設備，以豌豆為原料測定總黃酮含量，研究超聲波輔助提取豌豆總黃酮的工藝條件。采用單因素分析，對提取工藝進行初步分析，利用響應曲面法，在單因素試驗的基礎上對超聲波輔助提取豌豆中總黃酮物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，得到豌豆中總黃酮的提取最佳工藝參數(shù)，在此條件下得到的最佳提取率接近文獻中大豆異黃酮含量的最大值[9]，為進一步開發(fā)和利用豌豆資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干豌豆：上海易初蓮花超市；蘆丁標準品：國藥化學試劑有限公司；染料木苷標準品：上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇、硝酸鋁，、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、石油醚、磷酸均為分析純試劑：國藥化學試劑有限公司。試驗用水為蒸餾水。除特殊標明外所有乙醇溶液均為乙醇水溶液。

PB203-N電子分析天平：梅特勒托利多；XH-2008D型超聲波萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；FW177型中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；GT10-1型離心機：北京時代北利離心機有限公司；SHB-95型真空泵：鞏義市英峪儀器廠；UV-2000紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品標準曲線

精確稱取10 mg染料木苷標準試劑，用體積分數(shù)為95%乙醇水溶解，并完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，搖勻，得0.100 mg/mL的染料木苷標準溶液。分別吸取上述染料木苷標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，于6支10 mL容量瓶中并定容。用分光光度計在260 nm處測量吸光度[16]，得到吸光度A與染料木苷濃度C的回歸方程為：

1.2.2 樣品前處理

將豌豆放在恒溫干燥箱中80℃干燥至恒重，然后粉碎過80目篩子。過篩后的豆粉用石油醚脫去脂肪和色素，抽濾后放置于80℃干燥至恒重。處理好的豆粉樣品密封放置于冰箱中保存待用。

1.2.3 豌豆提取液黃酮含量的測定

精確稱取豌豆粉1 g，置于三口圓底燒瓶中，加入提取溶劑，將圓底燒瓶裝于超聲波合成萃取儀中，設定好提取條件，用超聲波輔助提取。提取液10 000 r/min離心10min然后抽濾，濾液用60%的乙醇定容到50mL作為待測溶液。分別取5 mL待測溶液到10 mL容量瓶中定容。按照測定染料木苷標準品的方法，在260 nm波長處測定吸光度A代入公式（1）得到提取液中總黃酮質(zhì)量m（以染料木苷為對照品），并按公式（2）（3）計算總黃酮提取率Q。

式中：m為提取液中黃酮總質(zhì)量，mg；M為豌豆粉質(zhì)量，g；A為260 nm波長處測定吸光度；5為5 mL待測溶液；10為5 mL待測溶液稀釋到10 mL；50為1 g豌豆粉提取黃酮待測溶液的體積50 mL。

1.2.4 超聲波輔助提取豌豆黃酮最佳條件的確定

在響應面優(yōu)化前通過單因素試驗對乙醇含量、pH值、提取時間、超聲波功率、液料比、提取溫度6個因素對超聲波輔助提取豌豆黃酮的影響進行分析。在單因素分析的結(jié)果上選取了乙醇含量、液料比、提取溫度這3個影響較大的因素進行響應面分析。響應面分析采用的是Design-Expert軟件，選用了常用的Box-Behnken的中心組合分析方法設計了三因素三水平共17個試驗點進行優(yōu)化分析。利用響應面優(yōu)化最終確定了超聲波輔助提取豌豆黃酮的最佳條件。

1.2.5 抗氧化活性研究

采取鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基（O2-·）清除率來表征抗氧化活性。取pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，25℃水浴加熱20 min，分別加入不同體積的樣品提取液使其最終濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL，再加入在25℃水浴中預熱的3 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3 mL，定容至10 mL，迅速搖勻后倒入比色皿中，以同體積的蒸餾水代替樣品提取液作為空白對照，在325 nm處，每隔30秒以測一次吸光度，共反應4 min；以吸光度A對反應時間t作線性關系圖，斜率即為自氧化法速率ΔA；鄰苯三酚的自氧化法速率用同體積的蒸餾水代替黃酮提取液進行測定，記為ΔA0；根據(jù)公式計算清除率：

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔA1為加入黃酮溶液后鄰苯三酚自氧化速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆中黃酮定性分析和測定方法的確定

在黃酮類化合物的紫外吸收光譜中，主要的吸收帶是300 nm～400 nm之間由B環(huán)桂皮?；到y(tǒng)電子躍遷引起的吸收帶Ⅰ和240 nm～285 nm之間由A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)電子躍遷引起的吸收帶Ⅱ組成。因為提取物中除黃酮類化合物外，還含有酚類、脂類、脂肪酸等化合物，在帶Ⅰ和帶Ⅱ范圍內(nèi)均有一定程度的吸收，會對黃酮的測定產(chǎn)生干擾。因此加入鋁鹽等使黃酮類化合物與其形成穩(wěn)定的配合物，可使吸收帶Ⅰ產(chǎn)生明顯紅移的同時增加吸光度，有利于測定提取物中總黃酮的含量。但有研究表明以蘆丁為對照品，以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH為顯色劑進行總黃酮含量測定的方法專屬性不強[5]，以此方法測定含量可能產(chǎn)生較大誤差。因此我們分別對蘆丁、染料木苷、豌豆黃酮提取液、NaNO2-A1（NO3）3-NaOH顯色的蘆丁和豌豆黃酮提取液進行了光譜掃描，譜圖見圖1。

從圖1可以看出，未顯色豌豆黃酮提取液的譜圖與染料木苷的相似度較高，在190 nm和260 nm左右有最大吸收峰，與蘆丁的譜圖差異度較大，蘆丁除在190nm和260nm左右有最大吸收峰，在300nm～400nm之間有一個大的吸收峰，而未顯色豌豆黃酮提取液與染料木苷的譜圖在這一波段只有非常小的吸收峰，這證明豌豆中黃酮主要是異黃酮類化合物，黃酮類化合物較少。從NaNO2-A1（NO3）3-NaOH顯色的蘆丁和豌豆黃酮提取液的譜圖進行分析，也可得出相同的結(jié)論。顯色蘆丁在510 nm左右有最大吸收峰，顯色的豌豆黃酮提取液在此波長吸收很小，而510 nm正是以蘆丁為對照品，以NaNO2-A1（NO3）3-NaOH為顯色劑進行總黃酮含量測定時經(jīng)常所用的波長，這將導致通常采用的以蘆丁為對照品，以 NaNO2-A1（NO3）3-NaOH為顯色劑測定的總黃酮含量并不能真實的反映實際情況。因此本文染料木苷為對照品，以260 nm為測定波長的方法，以便更準確的測定豌豆中總黃酮含量。

圖1 對照品、提取液的紫外可見光譜圖Fig.1 UV-vis spectra of reference substances and flavonoid extracting solution from beans

2.2 單因素試驗

提取條件對豌豆總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 提取條件對豌豆總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of the extraction factors on the extraction yield

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對黃酮類化合物提取的影響

稱取豆粉1 g，固定超聲波功率為500 W、提取時間 30 min、提取溫度 60℃、液料比為 20 ∶1（mL/g）、pH=8，分別用不同濃度的乙醇進行提取，試驗結(jié)果見圖2a。從圖中可以看出乙醇體積分數(shù)對黃酮的提取影響比較大，低濃度時提取率隨濃度增加而增加，濃度大于65%后隨濃度增加下降，說明豌豆黃酮在65%左右的乙醇中溶解度最大。

2.2.2 pH值對黃酮類化合物提取的影響

稱取豆粉1 g，提取溶劑為65%乙醇，固定超聲波功率為500 W、提取時間30 min、提取溫度60℃、液料比為20∶1（mL/g），分別在不同pH值下進行提取，試驗結(jié)果見圖2b。從圖中可以看出，在堿性條件下豌豆中的黃酮類化合物提取率更高，這一方面可能是堿性條件下黃酮與堿反應生成了溶解性較好的鹽，另一方面，可能是在此pH值下大豆蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶解性降低，促進了黃酮的溶出。

2.2.3 提取時間對黃酮類化合物提取的影響

稱取豆粉1 g，提取溶劑為65%乙醇，固定超聲波功率為500 W、提取溫度60℃、液料比為20∶1（mL/g）、pH=8，分別在不同時間下進行提取，試驗結(jié)果見圖2c。從圖中可以看出，30 min左右的提取時間可以達到最大的提取率，時間太短可能提取不完全，時間太長導致豌豆中其他物質(zhì)溶解量增加，影響黃酮類物質(zhì)的溶出。

2.2.4 超聲波功率對黃酮類化合物提取的影響

稱取豆粉1 g，提取溶劑為65%乙醇，固定提取時間 30 min、提取溫度 60 ℃、液料比為 20 ∶1（mL/g）、pH=8，分別在不同功率下進行提取，試驗結(jié)果見圖2d。從圖中可以看出在超聲功率為200 W～500 W之間，黃酮提取率隨超聲功率增加而增加，在500 W時，黃酮提取率達到最大值。超聲功率超過500 W后，提取率反而下降。這可能是超聲功率較低時，超聲波對豌豆細胞壁破碎程度隨超聲功率增大而加大，黃酮的浸出隨之增大，提取得率逐漸增加。但當超聲功率超過500 W后，超聲波所產(chǎn)生的破碎效應和熱效應同時使豌豆中雜質(zhì)的溶出增加，熱效應又使黃酮成分與這些雜質(zhì)分子相互反應，從而導致黃酮的提取率下降。因此，超聲提取黃酮的最佳功率選500 W。

2.2.5 提取液料比對黃酮類化合物提取的影響

稱取豆粉1 g，提取溶劑為65%乙醇，固定超聲波功率為500 W、提取時間30 min、提取溫度60℃、pH=8，分別采用不同液料比進行提取，試驗結(jié)果見圖2e。從圖中可以看出，液料比對黃酮類物質(zhì)提取率影響很大，20 ∶1（mL/g）左右的液料比效果最佳。

2.2.6 提取溫度對黃酮類化合物提取的影響

稱取豆粉1 g，提取溶劑為65%乙醇，固定超聲波功率為500 W、提取時間30 min、液料比為20∶1（mL/g）、pH=8，分別在不同溫度下進行提取，試驗結(jié)果見圖2f。從圖中可以看出，30℃～60℃范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨著溫度的升高而上升，至60℃時達到最大值。超過60℃后，隨著溫度的升高，提取率反而下降。這可能是在60℃之前提高超聲溫度，不但可以加快溶劑分子的擴散速度，而且也促進了黃酮分子的溶出速度，使更多的黃酮成分溶出，提取率提高。但當超聲溫度超過60℃后，溫度接近乙醇沸點，容易導致乙醇揮發(fā)，造成提取溶劑減少，同時溫度過高也可能造成黃酮類物質(zhì)破壞，從而導致了提取率的下降。所以，確定最佳超聲提取溫度為60℃。

2.3 響應面優(yōu)化分析

在單因素試驗的基礎上，選取對提取率影響比較大的溫度，液料比，乙醇體積分數(shù)3個因素進行三水平響應面優(yōu)化，其他條件則按照單因素試驗的最佳條件設置。試驗因素與水平設計如表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors the levels of experiment of response surface analysis

選用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，得到如表2所示設計方案。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及試驗結(jié)果Table 2 The Box-Behnken experimental design and results

統(tǒng)計分析后得到超聲波提取豌豆總黃酮提取率與各個因素的關系為：

對上述回歸方程進行發(fā)差分析，結(jié)果如表3。

表3 提取率回歸方程的方差分析表Table 3 Anova for the extraction yield

表3中模型（P＜0.000 1）失擬性值為5.2，說明模型很顯著。單因素決定因素（A，B，C）Prob＞F值均小于0.05，但是AB，AC交互作用大于0.05，同樣，單因素中A的決定值是最大的。誤差可能是由A溫度產(chǎn)生的。綜合來說模型達到了理想的模擬效果。3個因素的影響作用從大到小依次為：液料比＞乙醇體積分數(shù)＞提取溫度，其中液料比和乙醇體積分數(shù)效果顯著。雙因素交互對提取率Q的影響三維圖見圖3。

2.4 模型驗證

通過對超聲波輔助提取豌豆總黃酮進行響應面優(yōu)化得到最佳的提取條件為提取溫度：60.86℃，液料比 20.80∶1（mL/g），乙醇體積分數(shù)：63.58%。最佳的提取率為Q：1.098 mg/g。在驗證試驗中取溫度為61℃，液料比21∶1（mL/g），乙醇體積分數(shù)為65%，做4次平行試驗，平均提取率為Q：1.101 mg/g，相對誤差為0.30%。說明該優(yōu)化模型數(shù)據(jù)可靠，具有實用價值。

圖3 提取溫度與液料比、提取溫度與乙醇體積分數(shù)、乙醇體積分數(shù)與液料比對提取率的影響Fig.3 The influence of extraction temperature and liquid ratio，extraction temperature and ethanol volume fraction，ethanol volume fraction and liquid ratio extraction yield

2.5 抗氧化活性研究

采用鄰苯三酚自氧化法研究豌豆異黃酮提取液的超氧陰離子自由基清除作用，結(jié)果如圖4。

圖4 黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 The inhibition of flavones to O2-·

結(jié)果表明，豌豆異黃酮對超氧陰離子自由基的抑制作用具有濃度依賴關系，隨著異黃酮濃度的增大，對超氧陰離子的抑制率不斷增大。豌豆異黃酮對超氧陰離子自由基的抑制效果與文獻[17]基本一致。

3 結(jié)論

通過對照品、提取液的紫外可見光譜圖的對比分析，豌豆黃酮提取液在紫外區(qū)的吸收譜和染料木苷具有更好的擬合性，而與蘆丁的紫外可見吸收峰擬合性較差，說明豌豆黃酮主要是大豆異黃酮。采用響應面優(yōu)化超聲波輔助提取豌豆黃酮的試驗參數(shù)并建立數(shù)學模型，從模型分析中可以看出，以染料木苷作為對照品得到的數(shù)學模型是可靠的。

本試驗通過響應面優(yōu)化后得到超聲波輔助提取豌豆黃酮類化合物的最佳工藝條件為：提取溫度：60.86℃，液料比：20.80∶1（mL/g），乙醇含量：63.58%。在實際提取中選取提取溫度為61℃，液料比21∶1（mL/g），乙醇含量為65%，得到的豌豆黃酮提取率為1.101 mg/g。通過方差分析和模型驗證，證明該優(yōu)化工藝具有實用價值。對超氧陰離子自由基的清除作用表明豌豆異黃酮提取液具有一定抗氧化作用。

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