胡宏偉 ，余麗花 ，樊延明 ，李志賽 ，肖嘯 ，代飛燕

（1.云南省易門縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 易門 651100；2.云南省香格里拉市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 香格里拉 674400；3.云南省華坪縣通達(dá)鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 華坪 674800；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院，云南 昆明 650031）

豬流行性腹瀉是一種由豬流行性病毒引起的急性、高度接觸性腸道傳染病[1]，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是冠狀病毒科冠狀病毒屬的一員。發(fā)病豬是本病的主要傳染源，病毒主要分布在腸系膜淋巴結(jié)和小腸絨毛上皮細(xì)胞，隨糞便排出后通過污染環(huán)境中的飼料、飲用水及生產(chǎn)設(shè)備等進(jìn)行傳播[2]。一周齡仔豬腹瀉達(dá)3～4d，表現(xiàn)為嚴(yán)重脫水，死亡率達(dá)50%，最高為100%[3]。近年從中國(guó)分離到的CV777毒株是該病毒的一個(gè)新基因型[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 從山東夏津縣某豬場(chǎng)隨機(jī)選擇10頭未經(jīng)治療的流行性腹瀉病死仔豬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫膠體金層析試紙檢測(cè) 取免疫膠體金檢測(cè)試紙，在吸附孔中加入病死仔豬的腸內(nèi)容物樣品，吸附3min，即可獲得免疫膠體金層析試紙的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)

1.2.2.1 檢測(cè)樣品 豬場(chǎng)里腹瀉癥狀明顯的哺乳仔豬小腸內(nèi)容物，環(huán)境取樣棉拭子及料線中的母豬飼料樣品。小腸內(nèi)容物取樣：用消毒棉線結(jié)扎一段小腸的兩端，用火焰灼燒后的刀片在結(jié)扎端外側(cè)割斷腸管。從采集的10份病豬腸道內(nèi)容物中隨機(jī)抽取4份進(jìn)行檢測(cè)，從5份料線樣品和5份環(huán)境樣品中分別抽取2份進(jìn)行檢測(cè)。

待檢病料處理：用0.01mol/L磷酸緩沖液將病料稀釋成10%的懸液，然后1000r/min離心10min。取上清，加入氨芐青霉素和鏈霉素，在37℃溫箱中作用 1～2 h，-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 病毒增殖 將處理好的病料接種于長(zhǎng)滿單層的IBRS-2細(xì)胞，盲傳幾代至出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，收集病毒液-70℃凍存待用。IBRS-2細(xì)胞的培養(yǎng)方式根據(jù)常規(guī)傳代培養(yǎng)方法進(jìn)行。

（1）引物設(shè)計(jì)：參考劉鄧等[4]發(fā)表的“Taq Man熒光定量PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒”的方法設(shè)計(jì)上游引物 P1 為 5′-AACAAATCCAGGGCCACTT-3′，下游引物 P2 為 5′-TAAACTGGCGATCTGAGCA-3′。

（2）病毒核酸的提?。喝?00μL徹底融化的病毒液，加入500μL裂解液RL，室溫靜置2min，將gDNA Eraser Spin Column安放到2mL Collection Tube上，將裂解液轉(zhuǎn)移到gDNA Eraser Spin Column中；12000r/min 離心 1min，棄 DNA Eraser Spin Column，保留2mL Tube中的濾液；然后加入等體積的70%乙醇，使用移液槍將溶液混合均勻，立即全部轉(zhuǎn)入RNA Spin Column中；12000r/min離心1min，棄濾液；加入500 μL Buffer RWA 至RNA Spin Column中，12000r/min離心30s，棄濾液；加入600μL Buffer RWB至RNA Spin Column中，12000r/min離心30s，棄濾液，然后重復(fù)此步驟；將RNA Spin Column重新安置于Collection Tube上，12 000 r/min離心2 min；再次將RNA Spin Column安置于1.5 mL RNase-Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央處加入50μL RNase-Free ddH2O，室溫靜置5min；12 000r/min離心2min，洗脫RNA；采用紫外吸收法測(cè)定RNA純度。

（3）反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA：使用通用引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，根據(jù)表1反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和條件合成病毒cDNA。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

（4）用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表2所示。反應(yīng)條件為：95℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 免疫膠體金層析試紙檢測(cè) 免疫膠體金層析試紙檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示：對(duì)照線（C線）為陽性，對(duì)照成立；檢測(cè)線（T線）為陽性，樣品判斷為陽性。

圖1 免疫膠體金層析試紙檢測(cè)結(jié)果

2.2 熒光定量PCR檢測(cè) 結(jié)果（表3）顯示：檢測(cè)樣品 1、2、3、4 均為 PEDV陽性。

表3 腸內(nèi)容物熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步確定引起此次豬流行性腹瀉的來源，我們同時(shí)對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)的環(huán)境采樣和料線采樣進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：料線樣品1、2和環(huán)境樣品1、2均為PEDV陽性，如表4所示。

表4 環(huán)境和料線樣品的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

與常規(guī)PCR相比，本試驗(yàn)使用的熒光定量PCR不僅可以定量檢測(cè)，而且更具體、更靈敏。料線檢測(cè)結(jié)果呈陽性，提示本次豬流行性腹瀉病毒很可能來源于料線中，環(huán)境樣品檢測(cè)結(jié)果呈陽性，是因?yàn)閳?chǎng)內(nèi)豬只感染病毒后持續(xù)向外排毒引起環(huán)境污染，故要定期對(duì)豬場(chǎng)環(huán)境進(jìn)行消毒。

4 結(jié)論

通過免疫膠體金層析試紙進(jìn)行初篩，再用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定引起該豬場(chǎng)仔豬流行性腹瀉的病原為PEDV，且病原主要來自料線中，所以要注意料線的安全性。

[1] 甘振磊，李春燕，王彬，等.豬流行性腹瀉特點(diǎn)及流行現(xiàn)狀的研究[J].豬業(yè)科學(xué)，2010（12）：24-28.

[2] 羅滿林.動(dòng)物傳染病學(xué)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2013：195-200.

[3] 施標(biāo)，董世娟，朱于敏，等.中國(guó)豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（20）：4362-4369.

[4] 劉鄧，袁秀芳，冉多良，等.TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒方法的建立與初步應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18（1）：28-33.