蔡樹美，徐四新，張翰林，張德閃，呂衛(wèi)光，顧富家，諸海燾*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403；2上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403；3 農(nóng)業(yè)部上海農(nóng)業(yè)環(huán)境與耕地保護(hù)科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，上海 201403；4申農(nóng)(上海)生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，上海 202150)

我國耕地資源緊缺，灘涂是重要的后備土地資源，有著巨大的開發(fā)潛力和利用價(jià)值。然而灘涂土壤并非農(nóng)用耕地，惡劣的灘涂生態(tài)環(huán)境仍是制約人們更深層次利用這片資源的瓶頸。其限制因子主要包括土壤結(jié)構(gòu)差、含鹽量高、有機(jī)質(zhì)和全氮含量低等問題[1-3]。因此，如何合理利用和開發(fā)這片極具價(jià)值的土壤后備資源，已經(jīng)成為緩解當(dāng)前農(nóng)業(yè)用地日益緊缺矛盾、助推農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的難點(diǎn)之一。

面對灘涂資源生態(tài)不斷惡化的現(xiàn)實(shí)，以生物利用為核心的生物改良技術(shù)近年來日趨受到重視。通過紫云英等綠肥種植和農(nóng)田耕翻輪作等模式，提升土壤有機(jī)質(zhì)、增加碳匯、培肥地力，已經(jīng)成為近年來灘涂土壤生物改良的新趨勢。目前對灘涂紫云英-水稻輪作生物改良技術(shù)的試驗(yàn)研究，大多集中在土壤類型、水分、施肥、植被等非微生物學(xué)因素方面[4-8]，對固氮菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性等微生物學(xué)因素方面的野外試驗(yàn)研究相對較少。雖有報(bào)道顯示紫云英-水稻輪作能提高根際土壤和水稻根內(nèi)生微生物多樣性[9-10]，但對紫云英-水稻輪作生物改良行為下灘涂土壤特殊生理類群微生物群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)機(jī)制仍不清楚，制約了灘涂土壤土地利用效率和土壤改良效率的提高。

本研究通過分析紫云英-水稻輪作模式對灘涂土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和土壤環(huán)境因子的影響，并通過土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和土壤環(huán)境因子的相關(guān)性分析，比較固氮菌群落和土壤環(huán)境對紫云英-水稻輪作模式的響應(yīng)，為灘涂鹽堿地的生物改良技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2011年10月至2015年6月在上海崇明島東灘優(yōu)質(zhì)水稻種植功能區(qū)進(jìn)行(121o51′E，31o36′N)。該區(qū)域位于上海崇明東灘上實(shí)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)范圍內(nèi)，屬北亞熱帶季風(fēng)海洋性氣候，年均日照時(shí)數(shù)2 104 h，日照百分率47%，全年無霜期229 d，平均氣溫15.3 ℃，年均降水量 1 022 mm。由于園區(qū)位處新近形成的潮灘濕地，1990年才開始進(jìn)行大面積圍墾，土壤普遍存在鹽堿較重、肥力偏低等問題。在前期對200份土壤樣品的調(diào)查數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，pH＞7.5的土壤占比95.5%，其中pH＞8.5的堿性土壤占比24.0%；鹽分＞1 g/kg的土壤占比77.5%，部分土壤鹽分含量高達(dá)6 g/kg以上；有機(jī)質(zhì)含量＜10 g/kg的土壤占比40.5%，部分土壤有機(jī)質(zhì)含量低于2 g/kg。故此采取播種水稻、水稻-綠肥輪作等方式對園區(qū)土壤進(jìn)行洗鹽改造。

供試水稻為當(dāng)?shù)刂髟云贩N“花優(yōu) 14”，系上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的優(yōu)質(zhì)超高產(chǎn)、耐鹽性強(qiáng)的水稻新品種，供試紫云英為余江大葉籽，供試土壤為長江泥沙淤積而成的鹽漬沙壤土。試驗(yàn)區(qū)土壤地力偏低，地勢平坦。0～20 cm耕層土壤性質(zhì)為：全氮0.48 g/kg，全磷0.61 g/kg，全鉀16.4 g/kg，速效氮36.3 mg/kg，有效磷22.3 mg/kg，速效鉀198.2 mg/kg，有機(jī)質(zhì)4.42 g/kg，pH 8.55，全鹽 2.46 g/kg，EC 214.3 μS/cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置水稻-紫云英輪作區(qū)和水稻-冬季休閑區(qū)，每區(qū)面積66.7 m2。紫云英于每年10月5日播種，播種量為2.5 kg/667m2，于4月底全量翻壓還田。

試驗(yàn)從2011年起連續(xù)進(jìn)行4年，共計(jì)有4茬綠肥、4茬水稻。田間按照常規(guī)施肥方式進(jìn)行水肥管理，商品有機(jī)肥用量為3 000 kg/hm2，化肥用量折算為純N 270 kg/hm2，P2O5120 kg/hm2，K2O 150 kg/hm2。氮肥分4次施用：基肥50%，蘗肥(苗期)20%，拔節(jié)肥10%，穗肥占20%；磷肥100% 作基肥；鉀肥分為基肥 50% 與拔節(jié)期追肥 50%?；势贩N選用尿素(N 46%)、復(fù)合肥(15∶15∶15)、氯化鉀(K2O 60%)。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 樣品采集

選擇水稻-休閑和水稻-紫云英輪作改良 4年以上的田塊(編號分別為“1”、“2”)，分別采集土壤樣品。用土鉆采集剖面土壤樣品，采樣深度分別為0～10 cm(編號“a”)、10～20 cm(編號“b”)、20 ～40 cm(編號“c”)和 40～80 cm(編號“d”)。每個(gè)采樣點(diǎn)按連續(xù)“S”形采樣法均勻布10～15個(gè)點(diǎn)，用土鉆采集不同剖面深度土樣，將10～15個(gè)點(diǎn)土樣混合成1個(gè)混合樣品，每個(gè)樣地各取3個(gè)平行，共得24個(gè)混合土壤樣品。將樣品裝入已標(biāo)記的自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，去除石塊、昆蟲殘?bào)w、植物殘根等雜質(zhì)后待用。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

參照土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定；土壤樣品經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后，全氮用蒸餾定氮法測定，全磷用釩鉬黃比色法測定，全鉀用火焰光度計(jì)測定，速效氮用蒸餾定氮法測定，有效磷用鉬藍(lán)比色法測定，速效鉀用火焰光度計(jì)法測定，土壤全鹽用質(zhì)量法測定，EC用電導(dǎo)率法測定，pH用電位法測定[11]。另取部分新鮮土樣放入已滅菌的 2 ml 離心管中，并置于-80 ℃ 冰箱保存，用PCR-DGGE法分析土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)分析[12-13]，具體步驟如下：

1)采用Mobio Powersoil Isolation Kit試劑盒抽提土壤基因組DNA，固氮菌nifH 基因的 PCR 擴(kuò)增采用 Nested-PCR 程序。

2)第一次 PCR：所用引物為固氮菌 nifH 基因的引物 FGPH 19 和 Po1R，反應(yīng)體系為：BioLinker2× Taq Mix 20 μl，每種引物 1 μl，10 倍稀釋的土壤總 DNA提取液 1 μl，加 ddH2O 至反應(yīng)終體積 40 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 2 min；25 個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，56.4℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s；最后 72 ℃延伸 5 min。

3)第二次 PCR：反應(yīng)體系與第一次相同，模板為第一次 PCR 產(chǎn)物，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 2 min；20 個(gè)循環(huán)：94 ℃ 變性 30 s，56.4℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s；最后一步 72 ℃延伸 5 min，獲得約 320 bp(包括 40 bp 的 GC 夾)的基因片段。

4)Reconditioning PCR：繼續(xù)進(jìn)行 Reconditioning PCR以消除擴(kuò)增產(chǎn)物中異二聚體。反應(yīng)體系為：BioLinker2×Taq Mix 20 μl，每種引物 2 μl，巢氏擴(kuò)增產(chǎn)物 4 μl，加 ddH2O 至反應(yīng)終體積 40 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 2 min；5 個(gè)循環(huán)：94℃ 變性 30 s，56.4℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s；最后72 ℃延伸 5 min。

5)DGGE 分析：采用 BIO-RAD DcodeTM突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，美國)進(jìn)行固氮菌 nifH 基因的 DGGE分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%，變性劑梯度為 53%～75%(100% 的變性劑含有 7 mol/L尿素和40%(v /v)的去離子甲酰胺，電泳緩沖液為 1×TAE buffer。60 ℃、70 V 電壓下電泳 15 h。電泳結(jié)束后，用Biolinker DNA Red染色液進(jìn)行染色40 min，然后用 Bio-Rad 凝膠成像分析系統(tǒng)觀察樣品的電泳條帶并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Canoco for Windows 4.5 軟件對物種數(shù)據(jù)和相關(guān)環(huán)境因子數(shù)據(jù)進(jìn)行典范對應(yīng)分析(CCA)。物種數(shù)據(jù)采用固氮菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)Shannon-Weaver、均勻度指數(shù)Pielou Evenness和豐富度指數(shù) Richness)，用 lg(x+1) 進(jìn)行處理使之更趨于正態(tài)分布[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)差異

表 1顯示了土壤環(huán)境因子在不同輪作方式下的空間變化特征。在水稻-休閑方式下，0～10 cm和10 ～20 cm土壤剖面中總氮 (TN)、NH+4-N、有機(jī)質(zhì) (SOM)含量較高，隨著剖面深度加深，TN、NH4+-N、SOM含量下降趨勢明顯。在水稻-紫云英方式下，剖面深度對 TN、NH4+-N、SOM含量的影響比水稻-休閑方式下的影響小。總體來看，水稻-紫云英輪作可以降低土壤電導(dǎo)率 (EC)，并且使灘涂土壤中0～10 cm和10～20 cm土壤剖面的pH下降。

表1 不同輪作方式下灘涂土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemical properties under different rotation patterns

為進(jìn)一步明確土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系，對各環(huán)境因子進(jìn)行典范對應(yīng)分析(表2)，結(jié)果可見，土壤環(huán)境因子之間存在著相關(guān)性。TN和NH4+-N典型相關(guān)系數(shù)最高，與pH和有效磷(Olsen-P)的相關(guān)性次之；EC與、NO-3-N、Olsen-P之間的典型相關(guān)系數(shù)較高；pH與速效鉀(NH4OAc-K)的典型相關(guān)性高于其他土壤環(huán)境因子。

表2 環(huán)境因子之間的典型相關(guān)分析Table 2 Correlation coefficients between different environmental factors

2.2 土壤固氮菌PCR-DGGE分析

2.2.1 nifH基因的DGGE分析圖譜 采用Quantity one 4.6.2 對DGGE圖譜進(jìn)行條帶識別及相似性分析，每條泳道不同位置的條帶為土壤樣品中被分離的 PCR產(chǎn)物片段，屬于不同的固氮菌類群。從圖 1可以看出，DGGE電泳圖中各泳道條帶數(shù)目、強(qiáng)度、遷移率均存在一定差異，兩種輪作方式下40～80 cm土壤剖面中條帶數(shù)目均較少。水稻-紫云英輪作的土壤固氮菌群落豐富度高于水稻-休閑。水稻-紫云英輪作方式下，10～20 cm土壤剖面中條帶數(shù)目最多。

2.2.2 nifH基因的多樣性指數(shù) 群落多樣性通常與物種的豐富度和均勻度密切相關(guān)。本研究采用豐富度指數(shù)Richness、香農(nóng)指數(shù)Shannon-Weaver、均勻度指數(shù)Pielou Evenness對固氮菌群落多樣性進(jìn)行分析。香農(nóng)指數(shù)可反映群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度，均勻度指數(shù)用于反映群落均勻度。從表3可以看出，水稻-紫云英輪作方式下，不同剖面深度土壤的固氮菌多樣性指數(shù)總體上高于水稻-休閑；10～20 cm土層水稻-紫云英輪作方式中土壤固氮微生物群落多樣性表現(xiàn)為最高，固氮菌群落組成復(fù)雜，群落多樣性高于水稻-休閑。此外，對比兩種輪作方式發(fā)現(xiàn)，水稻-休閑40～80 cm土層土壤固氮微生物群落的多樣性顯著低于水稻-紫云英。

2.3 固氮菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分因子的關(guān)系

為進(jìn)一步研究土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，將DGGE指紋圖譜中每一條帶的光密度值作為物種數(shù)據(jù)，使用 CANOCO軟件將固氮菌群落與土壤理化性質(zhì)做典范對應(yīng)分析(表4)。結(jié)果顯示，固氮菌群落多樣性 CCA排序軸與環(huán)境因子相關(guān)。在前 3個(gè)排序軸中，固氮菌群落多樣性與環(huán)境的相關(guān)性分別為 0.983、0.946和 0.971，固氮菌群落多樣性與環(huán)境關(guān)系的變化累計(jì)比例分別為24.3%、41.6% 和 56.4%。前 3 個(gè)排序軸的固氮菌群落多樣性與環(huán)境關(guān)系方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到72.7%，排序結(jié)果可行有效，能較好地解釋固氮菌群落與環(huán)境之間的相關(guān)關(guān)系。

圖1 不同輪作模式下灘涂土壤nifH基因的DGGE分析圖譜Fig. 1 DGGE profiles of soil nifH genes under different rotation patterns

表3 不同輪作方式下土壤nifH基因的多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indexes of soil microbial nifH genes under different rotation patterns

采用典范對應(yīng)分析，將樣本與環(huán)境因子在同一個(gè)二維圖上反映出來，可以直觀地看出群落分布、物種分布與環(huán)境變量之間的關(guān)系。環(huán)境因子用箭頭表示，箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負(fù)相關(guān)性，箭頭連接長度代表該環(huán)境因子與樣本分布相關(guān)程度的大小，而箭頭連線間的夾角代表環(huán)境因子間的相關(guān)性大小[15-16]。從圖2可見，第 1 象限與 NO-3-N、pH呈正相關(guān)，與 TN、 NH4+-N、NH4OAC-K、SOM呈負(fù)相關(guān)；第 2 象限與 EC、Olsen-P表現(xiàn)為正相關(guān)；第 3 象限與 TN、 NH4+-N、NH4OAC-K、SOM表現(xiàn)出正相關(guān)，與 NO-3-N、pH為負(fù)相關(guān)；第 4 象限與EC、Olsen-P為負(fù)相關(guān)。其中，SOM與NO-3-N、EC與Olsen-P之間兩兩距離較近，說明在不同固氮菌群落分布的影響下，這兩組土壤環(huán)境因子兩兩之間的變異情況較為相似。從箭頭的連線長度可以看出影響土壤固氮菌群落的重要環(huán)境因子依次為SOM、NH4+-N、Olsen-P＞TN＞pH＞NH4OAC-K＞EC＞ NO-3-N。

表 4 CCA排序圖特征值及群落多樣性與環(huán)境的典型相關(guān)分析Table 4 Eigenvalues of CCA ordination diagram and correlations between special axes and environmental axes

3 討論

固氮菌是一類植物根際促生細(xì)菌，不僅具有固氮、溶磷、解鉀等作用，還能分泌植物生長激素、抗生素類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長，在維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定、物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量流動等方面發(fā)揮著重要作用[17-18]。作為生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的功能菌群，固氮菌的分布特征和數(shù)量通常與土壤氮、碳循環(huán)密切相關(guān)，直接影響土壤肥力。Poly等[19-20]借助 RFLPPCR技術(shù)研究了植被覆蓋、土壤的管理制度以及土壤理化性質(zhì)對nifH基因群落結(jié)構(gòu)的影響，通過主成分分析發(fā)現(xiàn)管理制度是影響土壤nifH基因多樣性的主因，理化性質(zhì)和植被覆蓋的影響次之。Bannert等[22]運(yùn)用定量 PCR和T-RFLP技術(shù)研究了中國浙江慈溪地區(qū)潮灘濕地與水稻田土壤固氮菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)的多樣性差異，結(jié)果表明，土壤pH的改變使得50 a稻齡水稻田的固氮菌數(shù)量比潮灘濕地大大增加。

圖2 固氮菌多樣性與土壤環(huán)境因子的CCA二維排序圖Fig. 2 Two dimensional ordination diagram of CCA of nitrogen microbial diversity and environmental variables

盡管固氮菌在不同生境中的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性成為近年來國際上的研究熱點(diǎn)，但在灘涂綠肥-水稻輪作這一特殊生境中固氮菌的相關(guān)研究還未見報(bào)道，對灘涂土壤綠肥-水稻輪作改良過程中固氮菌的分布和變化特征了解甚少，對其適應(yīng)和響應(yīng)機(jī)制的研究尚有待深入。本研究以灘涂土壤為研究對象，分析了灘涂紫云英-水稻輪作這一特殊生境中土壤剖面理化性質(zhì)、固氮菌群落結(jié)構(gòu)的變化及它們之間的關(guān)系，初步探討了固氮菌群落在紫云英-水稻輪作過程中對灘涂土壤改良所起到的作用。研究結(jié)果表明，經(jīng)過4年的連續(xù)紫云英-水稻輪作改良，土壤的理化性質(zhì)得到了一定的提高，土壤的有機(jī)質(zhì)含量增加、電導(dǎo)率和pH降低。受土壤理化性質(zhì)改善的影響，土壤固氮菌群落也有了積極的響應(yīng)，生物量及多樣性增加，能夠促進(jìn)土壤氮素循環(huán)、活化土壤養(yǎng)分、提高土壤肥力和營養(yǎng)元素有效性，確保作物健康生長。因此，在固氮菌的根際促生調(diào)節(jié)功能下，通過紫云英-水稻輪作，土壤環(huán)境得到明顯的改良，而土質(zhì)的改良又能穩(wěn)定固氮菌的群落結(jié)構(gòu)，提高土壤-作物-微生物之間的協(xié)同互作作用。

已有對不同生態(tài)系統(tǒng)土壤中固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成的研究顯示，環(huán)境因子和種植制度對固氮菌群落結(jié)構(gòu)存在影響。相關(guān)研究表明通過種植綠肥來改良灘涂，可以疏松土壤，減輕板結(jié)，增強(qiáng)土壤透水透氣性，減少表面土壤的積鹽，功能微生物的根際活動可以激活土壤中 CaCO3并加速其溶解，從而改善土壤理化性質(zhì)并加速土壤脫鹽[23-24]。紫云英-水稻輪作由于改良措施成本低、對環(huán)境擾動小、改良效果顯著的特征而被廣泛應(yīng)用于灘涂鹽堿地生態(tài)修復(fù)工程中。在本研究中，不同輪作方式對灘涂土壤環(huán)境有著不同的改良效果，對比水稻-休閑方式，水稻-紫云英輪作對10 ～20 cm土壤剖面中電導(dǎo)率、pH、固氮菌群落的改善作用最為顯著。兩種輪作方式下，土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因子變化的影響有較大差異，不同土壤剖面深度的固氮菌群落結(jié)構(gòu)也因受環(huán)境因子影響不同而存在差異。對土壤固氮菌群落影響較大的主要環(huán)境因子為有機(jī)質(zhì)、NH4+-N和有效磷。

4 結(jié)論

1)灘涂改良過程中土壤理化性質(zhì)變化規(guī)律存在著一定差異。其中，總氮和NH4+-N的相關(guān)性最高，與pH、有效磷的相關(guān)性次之；EC與NO-3-N、有效磷之間的相關(guān)性較高；pH與速效鉀的典型相關(guān)性高于其他土壤環(huán)境因子。

2)水稻-紫云英輪作的土壤固氮菌豐富度指數(shù)高于水稻-休閑，采用水稻-紫云英輪作方式更能提高灘涂土壤0～10 cm和10～20 cm剖面中固氮菌的Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)及其均勻度。

3)典范對應(yīng)分析表明，水稻-紫云英輪作方式與水稻-休閑方式下，灘涂土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因子變化的影響有較大差異，對土壤固氮菌群落影響較大的主要環(huán)境因子為有機(jī)質(zhì)、NH4+-N和有效磷。

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