吳松芹，汪成忠，李夢(mèng)莎

(1蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008；2 黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040)

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一[1]，是土壤元素循環(huán)與轉(zhuǎn)化的主要?jiǎng)恿χ籟2-3]，在生態(tài)系統(tǒng)功能以及全球生態(tài)系統(tǒng)地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。土壤微生物群落多樣性反映了土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化[6]，而通過對(duì)土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析，能夠?yàn)榻鉀Q生態(tài)系統(tǒng)功能的變化、制定保護(hù)和合理利用濕地資源的措施提供理論基礎(chǔ)[7-9]。因此，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能多樣性，對(duì)評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量、生態(tài)系統(tǒng)功能和土壤元素循環(huán)具有重要意義[10-11]。

大氣氮沉降改變了許多陸地生態(tài)系統(tǒng)類型的生物地球化學(xué)循環(huán)已是事實(shí)。了解氮沉降對(duì)濕地土壤微生物的影響及其機(jī)制對(duì)于濕地和環(huán)境管理具有重要意義。國(guó)外關(guān)于土壤微生物對(duì)氮沉降的響應(yīng)研究亦是近幾年才起步，大部分研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期氮沉降增加會(huì)給土壤微生物帶來不利影響[12-13]，但有關(guān)氮沉降對(duì)濱海土壤微生物的影響研究較少。本研究通過野外模擬試驗(yàn)，探討氮沉降增加對(duì)濱海濕地土壤微生物的影響，為研究氮沉降對(duì)濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究試驗(yàn)樣地位于江蘇省鹽城國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。自然保護(hù)區(qū)位于江蘇省鹽城市境內(nèi)，地理位置119°53′45″～121°18′12″ E，32°48′47″～34°29′28″ N，總面積約為 247 260 hm2，其中核心區(qū)面積 22 596 hm2，緩沖區(qū)面積 56 742 hm2，試驗(yàn)區(qū)面積 167 922 hm2。該區(qū)地處暖溫帶與北亞熱帶過渡地帶，氣候主要受到海洋與大陸性氣候影響，年平均氣溫為 13.7～14.6℃，年平均降雨量 1 000 mm，雨量集中在夏季，冬天多干旱，夏季涼爽(3月至8月) ，冬季溫暖(9月至次年2 月)。保護(hù)區(qū)的優(yōu)勢(shì)植物類型有眼子菜、狐尾藻、水車前、野菱和芡、扁桿草、草、糙葉苔草、鹽蒿、獐茅和白茅等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)樣地主要植物為蘆葦，伴生種有獐茅和白茅等。2010年5 月在試驗(yàn)區(qū)內(nèi)設(shè)置9塊10 m × 10 m 的施氮樣地，進(jìn)行3種處理：對(duì)照(N1，N 0 g/(hm2·a))、低氮 (N2，N 3 g/(hm2·a) ) 和高氮 (N3，N 6 g/(hm2·a))，每種處理 3次重復(fù)。當(dāng)年 5月份進(jìn)行施氮處理，將NH4NO3溶于水，用花灑均勻噴施。于2014年10月采集土壤樣品，用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法采集0～20 cm 土層，每個(gè)土樣由5～8 個(gè)采集點(diǎn)的土壤混合而成，用四分法取適量于土袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。帶回的土樣去除植物和動(dòng)物殘?bào)w等雜質(zhì)，混合均勻后一部分保存在4℃冰箱，用于分析土壤微生物群落功能多樣性。另一部分風(fēng)干，磨細(xì)，過 100目篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)(表1)。

表1 模擬氮沉降條件下土壤理化性質(zhì)的變化Table 1 Soil physical and chemical properties under different simulated nitrogen deposition levels

1.3 試驗(yàn)方法

本研究采用Biolog-ECO微平板法對(duì)不同氮沉降樣地土壤微生物功能多樣性進(jìn)行分析。具體方法參照Classen等[11]。首先，土壤樣品在25℃ 活化24 h，稱取相當(dāng)于10 g烘干土重的新鮮土樣加入內(nèi)有90 ml滅菌的生理鹽水的三角瓶中，加無菌棉花塞后，將三角瓶在旋渦振蕩器上震蕩1 min，然后置于冰水浴中1 min，反復(fù)3次。靜置2 min后按逐步稀釋法，依次稀釋 10-2和 10-3土壤懸浮液。用八通道移液器向ECO板每孔中加入10-3的土壤懸浮液，接種量為150μl，將接種好的微孔板放在(25±1)℃下連續(xù)培養(yǎng)13 d，每隔24 h用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處光密度值。

土壤pH測(cè)定的水土比為2.5∶1；土壤含水率采用烘干法測(cè)定；土壤有機(jī)碳利用碳氮分析儀測(cè)定(耶拿-2100S, 德國(guó))；土壤中全氮采用半微量凱氏定氮法測(cè)定；硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法測(cè)定；銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

微生物代謝強(qiáng)度采用平均顏色變化率 AWCD(average well color development)來描述，其是微生物利用單一碳源能力的重要指標(biāo)。采用 Biolog微平板培養(yǎng)168 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，此時(shí)即使生長(zhǎng)較慢的微生物也已參與碳源的代謝過程，因此能較全面地反映微生物群落的信息。采用Shannon多樣性指數(shù)、Simpson指數(shù)和 McIntosh指數(shù)來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性。

平均顏色變化率[14-16]：

式中：Ci為第i個(gè)碳源孔OD值；R為對(duì)照孔OD值，若Ci-R≤0，計(jì)為 0；ni是第i孔的相對(duì)吸光度值；Pi為ni與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，用S-N-K法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為 α=0.05；繪圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮沉降條件下土壤微生物對(duì)碳源利用的動(dòng)力學(xué)特征

從圖1可以看出，培養(yǎng)期間AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，其中，24～168 h時(shí)AWCD值快速增加，說明微生物不斷適應(yīng)ECO板各孔的環(huán)境，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，碳源被大量利用，此時(shí)微生物代謝活性旺盛；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，168 h以后土壤微生物緩慢步入穩(wěn)定期。比較不同氮沉降條件下土壤微生物群落 AWCD發(fā)現(xiàn)，高氮處理(N3)＞低氮處理(N2)＞對(duì)照(N1)，說明隨著土壤氮含量的增加AWCD值逐漸升高。

2.2 不同氮沉降條件下土壤微生物群落的多樣性指數(shù)

土壤微生物群落對(duì)不同碳源的利用情況可以用多樣性指數(shù)表示。表 2中顯示了土壤微生物在培養(yǎng)168 h的Shannon、Simpson和McIntosh多樣性指數(shù)，可在數(shù)量特征上相對(duì)反映土壤微生物群落物種組成和個(gè)體數(shù)量分布的情況。結(jié)果顯示，在3個(gè)氮沉降濕地中，隨著氮沉降的增加(表2)，土壤微生物Shannon指數(shù)和 McIntosh指數(shù)均表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。其中，高氮條件下的土壤微生物 Shannon指數(shù)和 McIntosh指數(shù)均最高，低氮次之，對(duì)照最低，各處理差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，而Simpson指數(shù)變化不顯著。

圖1 不同氮沉降條件下濕地土壤微生物的AWCDFig. 1 AWCD of soil microorganisms under different simulated nitrogen deposition levels

表2 不同氮沉降條件下濕地土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indexes of soil microbial communities under different simulated nitrogen deposition levels

2.3 不同氮沉降條件下土壤微生物群落對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度

Biolog-ECO板中含有31種碳源，包括碳水化合物類(10種)、氨基酸類(6種)、羧酸類(7種)、多聚物類(4種)、酚酸類(2種)和胺類(2種)。由圖2可知，不同氮沉降濕地土壤微生物群落對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度明顯不同，氮沉降濃度是影響不同碳源利用強(qiáng)度的重要因素，高氮樣地(N3)土壤微生物對(duì)于碳水化合物類、氨基酸類和胺類的利用強(qiáng)度較大；低氮樣地(N2)土壤微生物對(duì)碳水化合物類利用強(qiáng)度最大；對(duì)照樣地(N1)土壤微生物對(duì)氨基酸類利用強(qiáng)度最大。整體來看，土壤微生物對(duì)碳水化合物類碳源利用最多，其次是羧酸類和氨基酸類，對(duì)酚酸類的利用則相對(duì)較少，可見氮沉降改變了土壤微生物對(duì)碳源類型的利用。

2.4 不同氮沉降條件下土壤微生物群落功能主成分分析

圖2 不同氮沉降條件下土壤微生物群落對(duì)不同碳源的利用強(qiáng)度Fig. 2 Utilization intensities of different carbon sources by soil microbial communities under different simulated nitrogen deposition levels

對(duì)培養(yǎng)168 h的AWCD值進(jìn)行微生物群落功能主成分分析，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為62.18% 和9.82%，累積方差貢獻(xiàn)率為72%，說明PC1和PC2是微生物群落碳源利用變異的主要來源，可以解釋變異的絕大部分信息。從圖3可以看出，不同氮沉降處理濕地土壤微生物群落在碳源利用上有明顯的空間分異，而且在PC1和 PC2上的得分系數(shù)均差異顯著，可見土壤微生物群落碳代謝特征受到不同氮沉降的顯著影響。在PC2軸上，各樣地土壤微生物碳源利用的主成分分析得分排序?yàn)椋焊叩幚恚镜偷幚恚緦?duì)照，與AWCD值和多樣性指數(shù)的分析結(jié)果一致，總體呈現(xiàn)隨氮濃度的增加碳源利用活性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。不同氮沉降條件下土壤微生物群落明顯分為3簇。

圖3 不同氮沉降條件下濕地土壤微生物群落功能主成分分析Fig. 3 Principal component analyses of functions of soil microbial communities under different simulated nitrogen deposition levels

31種碳源在2個(gè)主成分上的載荷值見表3。從表 3可以看出與 PC1具有較高相關(guān)性的碳源有 13種，其中碳水化合物類6種、氨基酸類2種、羧酸類2種、多聚物類2種、酚酸類1種；與PC2具有較高相關(guān)性的碳源有9種，包括碳水類1種、氨基酸類4種、羧酸類3種、多聚物類1種、酚酸類1種。綜合PC1和PC2的結(jié)果可知，不同氮沉降處理濕地中對(duì)土壤微生物群落代謝功能起作用的主要碳源類型為碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類，不同氮沉降處理濕地的差異主要體現(xiàn)在對(duì)碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用上，其中碳水化合物類最為突出。

表3 31種碳源與PC1、PC2的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between 31 carbon sources and PC1, PC2

2.5 不同氮沉降條件下土壤微生物代謝特性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

將土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及土壤含水率和pH與土壤微生物群落多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見表4，pH與微生物的代謝活性(AWCD)和 Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；有機(jī)碳含量與Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)，與AWCD顯著正相關(guān)；全氮含量與Shannon指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)，而與McIntosh指數(shù)、AWCD顯著正相關(guān)。

表4 不同氮沉降條件下濕地土壤微生物多樣性指數(shù)與理化性質(zhì)的相關(guān)性Table 4 Correlation coefficients between soil physiochemical properties and diversity indexes of soil microbial community under different simulated nitrogen decomposition levels

3 討論

土壤微生物群落多樣性是反映土壤肥力、土壤環(huán)境變化過程的重要指標(biāo)之一，可以很好地揭示不同氮沉降條件影響下土壤微生物功能的差異，在生態(tài)系統(tǒng)功能中具有重要的意義。在本研究中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) AWCD值逐漸上升，且隨著對(duì)照-低氮-高氮濕地的變化 AWCD值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這與郁培義等[21]對(duì)不同氮添加條件下樟樹林紅壤土壤微生物群落多樣性的研究規(guī)律一致。

Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)分別表征土壤中微生物群落的豐富度、優(yōu)勢(shì)度以及均勻度[6]。在 3個(gè)氮沉降條件下，除 Simpson指數(shù)外，Shannon指數(shù)和 McIntosh指數(shù)均差異顯著。這說明土壤理化性質(zhì)影響了微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，這與很多研究的結(jié)果一致[22-23]。

土壤微生物群落對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度存在一定的差異，在3個(gè)不同氮沉降處理中，土壤微生物均對(duì)碳水化合物類碳源的利用率最高，其為優(yōu)勢(shì)碳源，主要包括β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂、D-木糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖；3個(gè)氮沉降處理土壤微生物功能多樣性的差異主要體現(xiàn)在對(duì)碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用上。這與朱凡等[22]等的研究結(jié)論是一致的。朱凡等[22]發(fā)現(xiàn)，不同施氮條件下土壤微生物對(duì)碳源的利用率有所不同，不同施氮條件下土壤微生物功能上的差別是由各微生物群落對(duì)碳源的總體利用率產(chǎn)生的差別。本研究發(fā)現(xiàn)氮沉降處理中土壤微生物群落對(duì)胺類碳源的利用效率也占到了20% 以上，而且對(duì)碳源的利用率具有很強(qiáng)的選擇性，說明在氮沉降后土壤微生物的多樣性發(fā)生了改變，對(duì)碳源的利用具有選擇性；不同氮沉降條件下濕地土壤微生物對(duì)碳源的利用率比較均衡，這也與朱凡等[22]的結(jié)果一致。說明土壤微生物所表現(xiàn)出的對(duì)碳源利用的不一致性是受到土壤性質(zhì)的影響，受到多因素的控制的。

土壤微生物對(duì)31種碳源的利用主成分分析結(jié)果顯示，3個(gè)氮沉降條件下土壤微生物對(duì)碳源的利用特征差異比較明顯，這一點(diǎn)可能和氮沉降進(jìn)入土壤后土壤養(yǎng)分發(fā)生改變有一定的關(guān)系。從對(duì)照-低氮-高氮，隨著施氮量的增加，土壤養(yǎng)分發(fā)生了變化，因而土壤微生物代謝特征發(fā)生一定的改變，使其對(duì)碳源利用的種類和強(qiáng)度均發(fā)生變化。郁培義等[21]和袁穎紅等[23]也指出，地上的模擬氮沉降通過改變土壤中氮的含量對(duì)土壤微生物功能代謝產(chǎn)生重要影響。此外，通過對(duì)土壤微生物的多樣性指數(shù)和AWCD值進(jìn)行主成分分析可知，3個(gè)氮沉降處理明顯出現(xiàn)分化，更為有力地證明了濕地條件下氮沉降的濃度變化會(huì)對(duì)土壤微生物的組成和功能活性產(chǎn)生重要的影響。

綜上所述，不同氮沉降條件下濕地土壤微生物群落代謝特征具有較為明顯的差異。不同氮沉降條件濕地由于其外源氮的大量輸入，導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化，這些是影響土壤微生物代謝活性的主要因素。但由于 Biolog-Eco微平板技術(shù)的局限性，僅采用此技術(shù)很難完整地反映不同氮沉降條件下濕地土壤微生物群落功能多樣性的變化規(guī)律。目前隨著其他技術(shù)手段的快速發(fā)展，結(jié)合多種微生物學(xué)研究方法，如磷酸脂肪酸( phospholipid fatty acid，PLFA) 譜圖分析法和分子生物學(xué)技術(shù)(如宏基因組技術(shù))，將為完整了解濱海濕地微生物群落結(jié)構(gòu)和功能等信息提供很好的途徑。

4 結(jié)論

綜合來看，氮沉降的增加明顯地改變了濱海濕地土壤微生物的功能活性，進(jìn)而引起土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成的變化。氮沉降的增加改變了土壤中有效元素組成，也改變了土壤微生物對(duì)不同碳源的利用模式，最終導(dǎo)致微生物功能活性發(fā)生改變。氮沉降的增加改變了濕地土壤中氮素濃度和形態(tài)，增加了土壤微生物的活性。所以，未來大氣氮沉降的持續(xù)增加會(huì)對(duì)我國(guó)濱海濕地土壤微生物功能活性產(chǎn)生影響。

[1] Wang S, Fu B J, Gao G, et al. Responses of soil moisture in different land cover types to rainfall events in a re-vegetation catchment area of the Loess Plateau, China[J].Catena, 2013, 101(3): 122-128

[2] Nurulita Y, Adetutu E M, Kadali K K, et al. The assessment of the impact of oil palm and rubber plantations on the biotic and abiotic properties of tropical peat swamp soil in Indonesia[J]. International Journal of Agricultural Sustainability, 2015, 13(2): 150-166

[3] Papanikolaou N, Britton A J, Helliwell R C, et al. Nitrogen deposition, vegetation burning and climate warming act independently on microbial community structure and enzyme activity associated with decomposing litter in low-alpine heath[J]. Global Change Biology, 2010, 16(11):3120-3132

[4] Li J, Zhou X, Yan J, et al. Effects of regenerating vegetation on soil enzyme activity and microbial structure in reclaimed soils on a surface coal mine site[J]. Applied Soil Ecology, 2015, 87: 56-62

[5] 于樹, 汪景寬, 李雙異. 應(yīng)用PLFA方法分析長(zhǎng)期不同施肥處理對(duì)玉米地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 28(9): 4221-4227

[6] 王光華, 劉俊杰, 齊曉寧, 等. Biolog和PCR—DGGE技術(shù)解析施肥對(duì)德惠黑土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 28(1): 220-226

[7] 張海涵, 唐明, 陳輝, 等. 不同生態(tài)條件下油松(Pinus tabulaeformis)菌根根際土壤微生物群落[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào),2008, 27(12): 5463-5470

[8] 郝曉暉, 胡榮桂, 吳金水, 等. 長(zhǎng)期施肥對(duì)稻田土壤有機(jī)氮、微生物生物量及功能多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 21(06): 1477-1484

[9] 范瑞英, 楊小燕, 王恩姮, 等. 黑土區(qū)不同林齡落葉松人工林土壤微生物群落功能多樣性的對(duì)比研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(2): 63-68

[10] Dong D, Zhang D P, Liu W C, et al. Diversity Analysis of Bacterial Community from Permafrost Soil of Mo-he in China[J]. Indian Journal of Microbiology, 2014, 54(1):111-113

[11] Classen A T, Boyle S I, Haskins K E, et al.Community-level physiological profiles of bacteria and fungi: Plate type and incubation temperature influences on contrasting soils[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2003,44(3): 319-328

[12] 林瑞余, 戎紅, 周軍建, 等. 苗期化感水稻對(duì)根際土壤微生物群落及其功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2007,27(9): 3644-3654

[13] Xie X M, Liao M, Ma A L, et al. Effects of contamination of single and combined cadmium and mercury on the soil microbial community structural diversity and functional diversity[J]. Chinese Journal of Geochemistry, 2011, 30:366-374

[14] Liao M, Xie X M, Peng Y, et al. Characteristics of soil microbial community functional and structure diversity with coverage ofSolidago CanadensisL. [J]. Journal of Central South University, 2013, 20(3): 749-756

[15] Jin Z, Ji F Y, Xu X, et al. Microbial and metabolic characterization of a denitrifying phosphorus-uptake/side stream phosphorus removal system for treating domestic sewage[J]. Biodegradation, 2014, 25(6): 777-786

[16] Velasco A G, Probanza A, Ma?ero F J G, et al. Effect of fire and retardant on soil microbial activity and functional diversity in a Mediterranean pasture[J]. Geoderma. 2009,153(1): 186-193

[17] 范瑞英, 楊小燕, 王恩姮, 等. 未干擾黑土土壤微生物群落特征的季節(jié)變化[J]. 土壤, 2014, 46(2): 285-289

[18] 岳冰冰, 李鑫, 張會(huì)慧, 等. 連作對(duì)黑龍江烤煙土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 土壤, 2013, 45(1): 116-119

[19] 江玉梅, 謝晶, 曹廣泮, 等. 江西退化紅壤人工重建森林土壤微生物碳源代謝功能研究[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2014(1):158-165

[20] 王秀國(guó), 王一奇, 嚴(yán)虎, 等. 多菌靈重復(fù)施藥對(duì)其持久性及土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào),2010, 47(1): 131-137

[21] 郁培義, 朱凡, 王志勇, 等. 氮添加對(duì)樟樹林紅壤微生物群落代謝功能的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013, 33(3): 70-74

[22] 朱凡, 李天平, 郁培義, 等. 施氮對(duì)樟樹林土壤微生物碳源代謝的影響[J]. 林業(yè)科學(xué), 2014, 8(8): 82-89

[23] 袁穎紅, 樊后保, 李輝信, 等. 模擬氮沉降對(duì)杉木人工林土壤微生物的影響[J]. 林業(yè)科學(xué), 2012, 9(9):8-14