沈丹杰，陳玥希，孫 輝，姚 建

(四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065)

土壤酶作為土壤物質(zhì)的生物地化循環(huán)過程最為重要的參與者，不僅參與土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化與礦化等生態(tài)與生物化學(xué)過程，同時也對土壤中的外源物質(zhì)轉(zhuǎn)化及維持土壤正常生態(tài)功能具有重要作用。因此，土壤酶在土壤生物地化循環(huán)、土壤生態(tài)和土壤環(huán)境方面具有至關(guān)重要的地位[1]。酶按照功能可分為氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類和連接酶類等6類，主要作為胞外酶形式存在的土壤酶主要涉及前4類[2]。土壤酶中，磷酸酯酶參與土壤中磷酸酯類物質(zhì)水解酶促反應(yīng)，與有機磷酸酯類的礦化與轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，與土壤有效磷顯著相關(guān)；纖維二糖水解酶和 β-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶系，纖維二糖水解酶作用于纖維素線狀分子非還原末端的β-1,4糖苷鍵，形成纖維二糖，β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成葡萄糖，這兩種酶對土壤有機碳的轉(zhuǎn)換過程至關(guān)重要，特別是土壤有機質(zhì)中最重要的碳水化合物纖維素的水解過程；β-N-乙酰氨基葡萄糖酶參與幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化氨基糖的過程，與土壤中有機氮相關(guān)組分轉(zhuǎn)化與礦化密切相關(guān)[3-8]。

土壤酶傳統(tǒng)的定量分析方法費時費力，重現(xiàn)性較差，以熒光物質(zhì)標(biāo)記底物的微孔板熒光法測定土壤酶活性的方法近年來逐漸發(fā)展起來[9-10]，被越來越多的土壤酶相關(guān)研究工作所采用[11-12]。微孔板熒光法的優(yōu)點在于可同時對多樣本的酶活性進行快速分析，獲得足夠的重復(fù)測量數(shù)據(jù)，測定時間短而且實驗條件相對穩(wěn)定一致，可有效減小系統(tǒng)誤差[13]。本文對微孔板熒光法測定酶活性的條件進行了一些改進，在此基礎(chǔ)上測定了高山樹線土壤幾種酶的動力學(xué)與熱力學(xué)特征。高山樹線交錯帶被認(rèn)為是對環(huán)境變化敏感的高寒生態(tài)系統(tǒng)之一，研究這些酶動力學(xué)與熱力學(xué)特征，對揭示全球變暖背景下高寒土壤生化過程及變化具有重要意義。

1 材料與方法

試驗采用微孔板熒光法測定土壤磷酸單酯酶(Phosphomonoesterase，EC3.1.3.2，PME)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21，BG)、β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(β-N-Acetyl-glucosaminidase，EC 3.2.1.52，NAG)、纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91，CBH)的活性，所用底物分別為4-甲基傘形酮-磷酸酯(MUF-P)、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUF-G)、4-甲基傘形酮-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷(MUF-NAG)和4-甲基傘形酮-纖維二糖苷 (MUF-C)。當(dāng)土壤酶作用于相應(yīng)底物時，熒光物質(zhì) 4-甲基傘形酮(MUF)釋放出來，通過多功能讀數(shù)儀測定溶液熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到相應(yīng)酶的活性與反應(yīng)速率。反應(yīng)方程如下所示。

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品采集 土壤樣品采集于四川阿壩藏族羌族自治州小金縣夢筆山海拔4 018 m的樹線交錯帶(31°42′15.7″N，102°19′18.7″E)，采樣時間為2016年6月中旬。每個樣品取3個重復(fù)，采集深度為 0～10 cm。用采樣鏟采集5個點的土壤樣品，混合均勻，各收集約 200g。土壤樣品采回后自然風(fēng)干，除去土壤里面的砂石、根系、植物殘體等，研磨并過篩，密閉保存。

1.1.2 實驗儀器 加液用八道移液器(Multichannel pipette，0～250 μl)；微孔板采用通用的黑色固體聚苯乙烯微孔板(Black solid polystyrene microplate，96- well，360-μl well capacity)；樣品培養(yǎng)采用恒溫培養(yǎng)箱；熒光值測定采用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(儀器型號Varionskan Flash，美國Thermo)。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤懸濁液的制備 將準(zhǔn)確稱量的 1 g土壤置入150 ml容積燒杯中，加入120 ml去離子水。并且使用攪拌子攪拌30 min使其混合均勻。每個樣品均需制備出兩份土壤懸濁液作為平行樣，分別標(biāo)記為土壤溶液1和土壤溶液2。

1.2.2 土壤溶液熒光值測定及熒光物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 土壤酶活性的測定時，采用改性通用緩沖液(modified universal buffer，MUB)保證反應(yīng)溶液pH的持續(xù)穩(wěn)定。每個土壤樣品做3個平行，每個平行測定4個重復(fù)值，測定的激發(fā)和發(fā)射波長分別為365 nm和450 nm。土壤酶活性用每小時每克土壤樣品的底物MUF (μmol) 轉(zhuǎn)化率表示。將土壤溶液置于不同濃度(0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mmol/L)的底物溶液中，于20 ℃ 恒溫條件下準(zhǔn)確培養(yǎng)10 min，而后加入NaOH終止反應(yīng)并立即測定微孔板的熒光值，即可測得土壤酶的

動力學(xué)參數(shù)。向土壤溶液中加入相同濃度的底物溶液，分別置于0、5、10、15、20、25、30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 h，培養(yǎng)后向微孔板中加入NaOH終止反應(yīng)并立即測定微孔板的熒光值，即可測得土壤酶的熱力學(xué)數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)溶液采用 4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone)配置，溶液中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度梯度為 0、5、10、20、30和 50 μmo/L。每一種土壤均需單獨測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，因為不同土壤顆粒對熒光物質(zhì)的抑制作用是不同的。土壤干擾下的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及空白樣(底物的自動水解)均做2個平行，每個平行測定4個重復(fù)值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 土壤酶動力學(xué) 在酶促反應(yīng)中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度、pH和酶濃度恒定時，反應(yīng)初速度(v)隨底物濃度([S])的增加而加速，最后達(dá)到最大反應(yīng)速度(V)。根據(jù)Michaelis-Menten方程式，以1/v對1/[S]作圖，即可得到不同酶促反應(yīng)的各項動力學(xué)參數(shù)。

式中：Km為米氏常數(shù)。

1.3.2 土壤酶熱力學(xué) 土壤呼吸的溫度敏感性用Q10來表示，即理論上溫度每增加 10 ℃ 土壤呼吸所增加倍數(shù)[14]。根據(jù)von't Hoff 規(guī)則，土壤酶溫度效應(yīng)以兩個溫度下酶促反應(yīng)的速度常數(shù)之比表示，不過土壤敏感性指標(biāo)在此基礎(chǔ)上多有修改[15]。本文采用以下修正式計算Q10：

式中：Q10為土壤酶的溫度敏感性指數(shù)；R1、R2分別為T1、T2溫度下土壤酶的潛在活性值。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酶的動力學(xué)特征

2.1.1 反應(yīng)初速率v0微孔板中各種物質(zhì)的加入量以及各種酶的反應(yīng)初始速率見表1。由表中可以看出，在土壤酶濃度相同時，土壤酶促反應(yīng)初速率v0隨著MUF底物濃度的增加而增加。同時，初速率穩(wěn)定性受到底物濃度影響，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.04 mmol/L時，土壤磷酸單酯酶(PME)的波動量為54.33%，β-葡萄糖苷酶(BG)的波動量為 61.00%；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0.16 mmol/L時，PME、BG波動量分別為11.39%、1.65%；而底物濃度達(dá)到0.28 mmol/L時，4種酶的波動量分別為 9.00%、1.37%、7.80%、21.57%。因此，底物濃度越小，反應(yīng)初速度波動愈大；隨著底物濃度增大，v0變化幅度呈降低趨勢，即酶促反應(yīng)初速率穩(wěn)定性增加。

表1 川西高寒表層土壤(0～10 cm)4種酶促反應(yīng)的初速度(v0)Table 1 Initial velocities (v0) of four enzymatic reaction of alpine topsoil (0-10 cm) in western Sichuan

2.1.2 酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù) 土壤酶動力學(xué)參數(shù)不但表明土壤酶含量的高低，且反映酶與底物結(jié)合的緊密程度及其作用過程，對探索土壤酶存在狀態(tài)以及各種因素對酶催化反應(yīng)不同階段的影響有重要意義。應(yīng)用Michaelies方程對PME、BG、CBH、NAG這4種酶動力學(xué)參數(shù)進行擬合，所得米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率V參數(shù)見表2。

最大反應(yīng)速率V可以反映出土壤中該酶的酶-基質(zhì)復(fù)合體分解形成產(chǎn)物的速度，由表2可以看出，高寒土壤中4種酶最大反應(yīng)速率為PME＞BG＞NAG＞CBH。米氏常數(shù)Km表示酶對底物的親和力大小，Km值越大親和力越小，即酶與底物結(jié)合形成酶-基質(zhì)復(fù)合體越困難，結(jié)果顯示這4種酶與底物結(jié)合的親和力大小為 CBH＞BG＞NAG＞PME。V/Km反映了酶促反應(yīng)初始速率，該值越大酶與底物結(jié)合形成酶-基質(zhì)復(fù)合體和酶-基質(zhì)復(fù)合體分解形成產(chǎn)物的總反應(yīng)速率越快，酶的催化效率越高，本研究中這4種酶的催化效率為PME＞BG＞CBH＞NAG。

表2 川西高寒表層土壤(0～10 cm)4種酶的動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of PME, BG, CBH and NAG of alpine topsoil (0-10 cm) in western Sichuan

在土壤溶液酶促反應(yīng)體系中，土壤膠體對底物有一定的吸附能力，從而使酶促反應(yīng)更容易進行。但米氏方程計算土壤酶的動力學(xué)參數(shù)時，沒有考慮到土壤顆粒的吸附性，因此得到的Km值可能略大于真實值。

2.2 土壤酶熱力學(xué)特征

2.2.1 土壤酶活性的溫度效應(yīng) 不同土壤酶的溫度效應(yīng)趨勢見圖1。數(shù)據(jù)表明，在0～25 ℃的溫度范圍內(nèi)，PME、BG、CBH的活性隨溫度的升高而增加；在25～35 ℃的溫度范圍內(nèi)，這3種酶的活性均保持在較穩(wěn)定的范圍內(nèi)。NAG在0～35 ℃區(qū)間內(nèi)，活性隨溫度升高而持續(xù)上升。

2.2.2 土壤酶活性的溫度敏感性 不同溫度下土壤酶活性敏感性指標(biāo)Q10見表3。在0～35 ℃ 范圍內(nèi)，4種酶對溫度的敏感性為：CBH＞NAG＞BG＞PME。從表中看出，在10～20 ℃ 范圍內(nèi)PME、BG、CBH、NAG的Q10均達(dá)到最大值，分別為3.25、3.80、10.22和6.31。結(jié)果表明，隨著土壤溫度的上升，土壤酶的溫度敏感性是先升高后降低，在 10 ～20 ℃達(dá)到最大值。在高溫區(qū)間(20～35 ℃)，4種酶的溫度敏感性較低溫區(qū)間(0～20 ℃)有顯著降低。

圖1 不同溫度下川西高寒表層土壤(0～10 cm)的酶活性變化趨勢Fig. 1 Changes in enzyme activities of alpine topsoil (0-10 cm) with temperature in western Sichuan

表3 川西高寒表層土壤(0～10 cm)中4種酶在不同溫度段的Q10值Table 3 Q10 values of four enzymes of alpine soil (0-10 cm) in different temperature intervals in western Sichuan

3 討論

3.1 酶的動力學(xué)特征

本文以 4-甲基傘形酮衍生物為底物測量了磷酸單酯酶(PME)、β-葡萄糖苷酶(BG)、纖維二糖水解酶(CBH)和 β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(NAG)的動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果與Stemmer[16]以及Parham和Deng[17]的結(jié)果范圍一致。與已報道文獻的平均值相比，本文 PME和BG的Km偏小，而NAG的Km偏大。這可能是由于在以土壤為代表的非均相系中，Km值受到酶構(gòu)象的改變、酶活性位點對底物或抑制物的可接近性、產(chǎn)物與底物的擴散效應(yīng)和微環(huán)境效應(yīng)等多項因素的影響。

在酶活性測量的過程中，底物的選擇會對結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。國際上沒有規(guī)定土壤酶測定的標(biāo)準(zhǔn)化底物，目前較為常用的示蹤底物主要為對硝基酚(p-Nitrophenyl, pNP)類衍生物和甲基傘形酮(MUF)類衍生物兩大類。對硝基酚測量方法的研究起源較早，早在 1969年就有文獻報道利用對硝基苯磷酸鹽(p-nitrophenyl phosphate)測量土壤磷酸酶的活性[18]。由于對硝基酚類衍生物的種類豐富，目前已廣泛用于水解酶和酯酶的研究[17,19-22]，不過對硝基酚易被土壤膠體吸附，土壤顆粒本身帶有的顏色也會影響測定結(jié)果，并且該方法靈敏度較低，不能用于低活性土壤酶的測定[23]。同時，對硝基酚衍生物在土壤溶液中的擴散性不如4-甲基傘形酮衍生物[10]，故以4-甲基傘形酮衍生物為底物的測定會導(dǎo)致Km值偏小。以 4-甲基傘形酮為底物的熒光法，憑借其高靈敏性、高準(zhǔn)確度和受土壤顆粒顏色影響小的特點，在測量酶活性的研究中發(fā)展迅速。但無論是哪種方法，都不能忽略土壤對底物的吸附作用，而土壤對底物的吸附作用往往很難測定與計算。因此，研究中往往選擇稀釋倍數(shù)高的土壤溶液測量酶活性，以忽略土壤對底物的吸附作用。Marx等[10]和 Stemmer[16]也選擇 MUF作為底物測量多種酶的活性，但本文PME和BG的Km值均比相關(guān)文獻低。原因可能在于本研究是將1 g土壤稀釋成120 ml的土壤溶液作為酶測定的背景溶液，Marx等是將1 g土壤稀釋成100 ml的土壤溶液，而Stemmer則僅將0.5 g的土壤稀釋成2 ml的土壤溶液，本研究中的土壤溶液稀釋度較大導(dǎo)致土壤對底物的吸附作用減弱，短時間內(nèi)MUF底物擴散不良，從而引起相應(yīng)酶的Km值降低。

3.2 土壤酶的溫度敏感性

土壤溶液的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度均會對酶的溫度敏感性的測定結(jié)果產(chǎn)生影響。培養(yǎng)溫度對酶活性的影響最為直接，就PME而言，Q10在10～20 ℃ 時大約為3.25，即培養(yǎng)過程1 ℃ 的溫差將導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn) 22.5% 的變異。因此，要獲得準(zhǔn)確結(jié)果就需要精確地控制培養(yǎng)溫度。

由圖2可以看出，研究區(qū)域春夏日均溫為0～13 ℃，其中晝間的土壤溫度大多在10～20℃，少數(shù)時間段會升至20 ℃以上，但持續(xù)時間都較短，春夏夜間僅0 ～9 ℃；秋季均溫在 0～5 ℃；而冬季均溫大多在 0 ℃ 以下。因為這4種土壤酶在10～20 ℃的溫度敏感性最高，故該溫度區(qū)間的酶活性變化能最大程度反映全球變暖對該區(qū)域酶活性的影響。有研究表明，青藏高原地區(qū)未來的升溫幅度約0.6℃/10a，這一結(jié)果與ICPP在2013年發(fā)布的第五次報告中的 PCR8.5情景大體一致。高山地區(qū)的溫度變化往往伴隨著光照、水分等多種環(huán)境因子的變化，其實質(zhì)是通過改變山地區(qū)域小氣候、土壤理化特征等環(huán)境系統(tǒng)，對土壤微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)以及土壤酶活性造成影響[24-25]。研究區(qū)域土壤0～10 cm深度的日均溫在10 ℃以下，未來可預(yù)見升溫情形下，高寒土壤表層均溫也在20 ℃以內(nèi)，因此本文對未來50 a升溫條件下表層土壤酶活性及增幅進行了預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。

圖2 研究區(qū)域土壤表層(0～10 cm)年均溫度(2011—2015)Fig. 2 Changes of daily average temperature of topsoil(0-10 cm) in study area from 2011 to 2015

圖3 預(yù)期升溫情形下(2017—2070)川西高寒土壤表層的酶活性及增加幅度Fig. 3 Estimated activities of four enzymes of alpine topsoil(0-10 cm) from 2017 to 2070 under soil warming scenariosin western Sichuan

按照 0.6℃/10a的增溫幅度計算，到 2070年P(guān)ME、BG、CBH和NAG的春夏晝間酶活性將增加約 0.678、0.427、0.066 和 0.114 μmol/(g·h)，增幅達(dá)到46.50%，54.12%，112.35% 和81.64%，這期間春夏夜間以及秋季晝夜 4種酶的活性增加約 0.177、0.102、0.018 和 0.064 μmol/(g·h)。因此，持續(xù)升溫可能會對高寒土壤相關(guān)生化過程產(chǎn)生明顯影響，特別是在春夏季節(jié)影響更為顯著。

4 結(jié)論

1) 在動力學(xué)方面，磷酸單酯酶(PME)和 β-葡萄糖苷酶(BG)的活性及催化效率均顯著大于纖維二糖水解酶(CBH)和β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(NAG)，有機磷循環(huán)比有機碳、氮循環(huán)活躍。在底物濃度為0～0.28 mmol/L時，高寒土壤PME，BG，CBH，NAG 4種酶的活性隨著底物濃度的增加而上升。酶對底物的親和力(Km)和初始反應(yīng)速度(Km/Vm)共同決定著酶促的反應(yīng)速率和酶對底物的催化效率。

2) 在熱力學(xué)方面，亞高山森林土壤酶的溫度敏感性在高溫區(qū)間反而較低。高寒土壤 PME，BG，CBH，NAG 4種酶的活性隨著溫度升高呈現(xiàn)出兩種變化趨勢，即持續(xù)增長型(NAG)和先升高后穩(wěn)定型(PME、BG、CBH)。溫度變化時，土壤酶的溫度敏感性先升高后降低，在10～20 ℃ 時達(dá)到最高。川西高寒土壤4種酶在低溫區(qū)間(0～20 ℃)具有較高的溫度敏感性。

因此，川西高寒土壤酶在低溫階段對氣溫變暖響應(yīng)敏感，高寒土壤升溫會引起相關(guān)酶參與的土壤生態(tài)與生化過程的急劇變化，這對揭示增溫背景下高寒土壤生態(tài)系統(tǒng)生物地化循環(huán)的效應(yīng)特征具有重要理論意義。

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