紀 洋，于海洋，CONRAD Ralf ，徐 華*

(1 南京信息工程大學應用氣象學院，南京 210044；2 土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；3 Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg 35043)

稻田是大氣 CH4排放的重要來源，其 CH4排放量達25.6 Tg/a[1]。我國水稻種植面積占世界總種植面積的20%，其水稻產量占世界總量的32%～35%[2]。稻田CH4排放包括 CH4產生、再氧化和傳輸3個過程[3]，其中前兩個過程與土壤中產甲烷菌和甲烷氧化菌的數量及活性密切相關。產甲烷菌功能基因mcrA控制甲烷化的最后一步反應，將輔酶M連接的甲基催化還原為CH4[4]，甲烷氧化菌功能基因pmoA編碼利用甲烷的第一個關鍵酶，將甲烷氧化為甲醇[5]。因而稻田土壤中含有上述基因的功能微生物種群豐度結構及其演變規(guī)律受到廣泛關注。

以前期淹水、中期烤田和后期干濕交替為特征的間隙灌溉是我國稻田主要的水分管理措施[1]。大量研究表明，相對于持續(xù)淹水，稻田烤田可顯著抑制水稻生長期 CH4排放。水稻生長季持續(xù)淹水造成稻田極端厭氧，有利于 CH4的產生排放；相反，間隙灌溉模式下烤田增加土壤通透性，土壤中原有的還原狀態(tài)被破壞，土壤Eh迅速增加，土壤CH4的生成受到限制[6]；烤田期間土壤氧化CH4能力的提高是導致CH4排放減少的另一個原因[7-8]。然而有關間隙灌溉抑制稻田 CH4排放的微生物機理尚不清楚?？蒯尫适羌冗m應作物全生長季不同生育階段氮素營養(yǎng)的需求，而又不使土壤中剩余無機氮濃度過高的一種可控釋放氮肥。目前有關控釋肥對稻田 CH4排放影響的研究結果不一致。李方敏等[9]大田試驗研究表明，稻季控釋肥處理CH4排放量是尿素處理的2～3倍；林匡飛等[10]兩季稻試驗表明控釋肥施用均顯著降低50% 左右的早、晚稻CH4排放量；筆者前期研究發(fā)現(xiàn)稻季尿素處理和控釋肥處理 CH4排放量之間無顯著差異[11]。然而有關控釋肥施用對稻田土壤微生物種群的影響，尤其是對與 CH4排放相關的功能微生物種群的了解很少。羅蘭芳等[12]研究表明，短期施用控釋氮肥的稻田土壤中細菌、真菌和放線菌數量明顯高于不施氮處理；土壤氨化細菌、反硝化細菌的數量比尿素處理低；但控釋氮肥處理的周年土壤細菌、放線菌數量明顯高于尿素處理，真菌數量略低于尿素處理，說明控釋肥能明顯增加土壤微生物的數量。劉蕊等[13]發(fā)現(xiàn)控釋尿素提高了小麥近根區(qū)土壤微生物的功能多樣性和活性，促進了小麥近根區(qū)養(yǎng)分的轉化和循環(huán)。張怡等[14]研究發(fā)現(xiàn)控釋肥增加了覆膜栽培稻田土壤細菌數量，提高了土壤微生物生物量氮。以上研究均采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，對土壤微生物的認識十分有限。近年來，隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，基于16S rDNA基因及其他功能基因的非培養(yǎng)技術，包括聚合酶鏈式反應(PCR)，克隆文庫技術(Clone)和核酸定量技術(real-time PCR)的出現(xiàn)為揭示自然環(huán)境中微生物群落結構多樣性的分子生態(tài)學研究開辟了一個全新的研究平臺[15]。

本研究通過采集稻季田間原位試驗新鮮土樣，采用核酸定量技術(qPCR)和末端限制性片段長度多態(tài)性技術(T-RFLP)，研究間隙灌溉和控釋肥施用對與CH4排放相關的土壤微生物群落豐度和結構的影響，探討不同水肥管理條件下稻田CH4排放的微生物機理，從而為農田系統(tǒng)溫室氣體減排提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗方案及樣品采集

供試土壤是采自于2011年江蘇省句容市行香鎮(zhèn)(31°58′N, 119°18′E)水稻生長季田間原位新鮮土。試驗地屬北亞熱帶季風氣候區(qū)，年平均氣溫15.1℃，年平均降雨量為1 100～1 200 mm。試驗土壤為發(fā)育于下蜀黃土的爽水性水稻土，其基本理化性質為：pH 6.91，有機碳含量為18.9 g/kg，全N含量為1.2 g/kg，砂粒(2～0.02 mm)14%，粉粒(0.02～0.002 mm)69%，黏粒(＜0.002 mm)17%，土壤WHC為 55%。

試驗共設3個處理：①對照處理(CK)：不施氮肥；②尿素處理(U)：稻季尿素施用量為N 240 kg/hm2，麥季尿素施用量為N 200 kg/hm2；③控釋肥處理(C)：與尿素處理相同施氮量。本試驗所施用的控釋肥為山東金正大生態(tài)工程股份有限公司生產的可降解樹脂包膜尿素肥料，含氮量為42%。小區(qū)面積均為3 m ×5 m，每個處理3次重復，隨機區(qū)組排列。

田間管理措施與當地農民的大田管理相同。稻季尿素按基肥∶分蘗肥∶穗肥為 50%∶25%∶25% 施用(施用時間分別為2011年7月2日、7月22日和8月20日)；控釋肥作為基肥一次性施入。所有處理均施用450 kg/hm2的過磷酸鈣和225 kg/hm2的氯化鉀，作為基肥一次性施入。水稻品種為華粳3號，

于7月2日移栽(水稻移栽密度為24穴/m)，11月6日收割。水分管理參照當地稻田常規(guī)管理方式，采用傳統(tǒng)的前期淹水(7月1日—8月1日)、中期烤田(8月2日—8月13日)、后期干濕交替(8月14日—10月7日)和末期排水落干(10月8日—11月6日)的管理模式。

稻季土壤樣品分別在淹水期(7月23日)、烤田初期(8月3日)、烤田末期(8月11日)和水稻成熟前排水落干期(11月4日)采集。各小區(qū)按“S”形多點采樣法取表層(0～15 cm)土壤混合。取200 g新鮮土壤用液氮冷凍后-80 ℃ 保存，供分子生物學研究。

1.2 土壤DNA提取

稱取 0.5 g 土壤用 Fast DNA SPIN KIT 試劑盒(MP Biomedicals, Eschwege, Germany)提取總DNA，操作按說明書進行。所提 DNA 質量與長度通過 1%凝膠電泳檢測。所得 DNA 均稀釋 10 倍后再進行下游實驗。

1.3 定量PCR

細菌16S rRNA基因、古菌16S rRNA基因、產甲烷菌功能基因mcrA和甲烷氧化菌功能基因pmoA的定量PCR分析均采用SYBR Green染色法。各基因定量PCR所用的引物和參考文獻如表1所示。

表1 各目標基因定量PCR所用引物及參考文獻Table 1 Primers and references used in qPCR

1.4 古菌的T-RFLP分析

根據不同處理下古菌 T-RFLP 圖譜的差異研究間隙灌溉和控釋肥施用對稻田土壤古菌群落結構的影響。采用正向引物為 109f，反向引物為 915r[16]，其中反向引物 5′ 端用 6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標記的古菌通用引物擴增古菌 16S rRNA 片段[17]。擴增后的產物用TaqI進行消化酶切，酶切產物用ABI 3130 DNA sequencer(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)進行自動測序分析。T-RFLP圖譜中每一個限制性片段(T-RF)作為一個 OTU(operational taxonomic unit)，T-RFs片段大小 ±1 bp是同一個OTU。

1.5 數據分析

采用 SPSS 13.0 for Windows(SPSS Inc., USA)軟件對不同處理的功能基因數目進行顯著性差異分析(One-way ANOVA)。采用R3.0.0軟件對不同處理古菌 T-RFs片段結構進行典型相關性分析(canonical correspondence analysis，CCA)。

2 結果與分析

2.1 稻季土壤微生物的群落豐度

圖 1表示稻季不同水分管理時期土壤細菌、古菌、產甲烷菌(mcrA)和甲烷氧化菌(pmoA)群落豐度變化。土壤中檢測到的細菌數量多于古菌，介于2.1×109～6.0×109copies/g干土之間。隨著水稻生長，各處理細菌數量逐漸降低。與不施氮肥的對照處理相比，在水稻生長前期的淹水期、烤田期和烤田末期，施用尿素和控釋肥均促進細菌數量增加，其中尿素處理細菌數量高于控釋肥處理；而在水稻收獲前的落干期，施用尿素降低細菌數量，施用控釋肥對細菌數量沒有明顯影響。檢測到的古菌數量在 1.3×108～3.8×108copies/g干土之間，隨著水稻生長，各處理古菌數量逐漸增加。與不施氮肥的對照處理相比，施用尿素和控釋肥均降低稻季古菌數量；與尿素相比，施用控釋肥增加土壤中古菌數量。

產甲烷菌(mcrA)數量分別介于 5.0×106～2.1×107copies/g干土之間?？咎锍跗诤涂咎锬┢诘漠a甲烷菌數量均小于淹水期和收獲前的落干期。在淹水期，水稻正處于幼苗期，施用尿素和控釋肥均促進產甲烷菌數量增加，隨著水稻生長，氮肥施用逐漸抑制產甲烷菌生長。在水稻收獲前的落干期期，尿素和控釋肥均顯著抑制產甲烷菌生長，其中控釋肥處理產甲烷菌數量高于尿素處理。甲烷氧化菌(pmoA)數量介于 1.2× 107～4.2×107copies/g干土之間，且隨著水稻的生長而增加。在水稻生長前期的淹水期、烤田初期和末期，尿素施用抑制甲烷氧化菌生長，隨著水稻的生長，在水稻收獲前的落干期，尿素施用促進甲烷氧化菌生長；在整個稻季，控釋肥施用抑制甲烷氧化菌生長，但其抑制作用小于尿素處理。

圖1 稻季土壤微生物的群落豐度Fig. 1 Abundances of soil microorganisms during the rice growing season

2.2 稻季古菌群落的T-RFLP對比分析

根據毛細管凝膠電泳分離后所得到的有效T-RF數目來確定樣品中古菌種群數，每個T-RF所對應峰的面積反映了該種群的豐度，而每個不同長度 T-RF的峰面積在所有T-RF的峰面積總和中的比例可以反映這個片斷在酶切產物中的相對豐度，從而間接反映出這個片斷所代表的物種在微生物群落中的相對豐度。圖2表示水稻不同生長時期古菌群落組成的T-RF相對豐度變化。

由圖2可知，整個水稻生長季，土壤古菌群落結構相似性較高，優(yōu)勢T-RFs長度為184 bp和391 bp，相對豐度分別是23%～55% 和11%～26%。184 bp片段在處于水稻生長前期的淹水期和烤田初期相對豐度較高(45%～55%)，但隨著烤田的進行逐漸下降，在烤田末期和水稻收獲前的落干期僅占23%～30%；而391bp片段逐漸增加，其相對豐度由12%～18% 增至23%～26%，說明在水稻生長季，隨著間隙灌溉的進行，古菌群落結構處于動態(tài)變化中。圖3所示為利用典型相關性分析(CCA)研究間隙灌溉和氮肥施用對土壤古菌群落結構的影響。CCA分析表明間隙灌溉顯著影響土壤古菌群落結構(P＜0.001)，其中淹水期和烤田前期、烤田末期、收獲前落干期的土壤古菌群落聚集于3個不同區(qū)域。而控釋肥和尿素施用對土壤古菌群落結構沒有明顯影響，不施氮處理、尿素處理和控釋肥處理土壤古菌群落聚集區(qū)域沒有明顯規(guī)律。

圖2 稻季土壤古菌的群落組成Fig. 2 Archaeal community composition in the soils during the rice growing season

圖3 稻季土壤古菌群落結構的典型性對應分析(CCA)Fig. 3 Canonical correspondence analysis (CCA) of archaeal community composition in the soils during the rice growing season

3 討論

3.1 稻季CH4排放與土壤微生物豐度的關系

土壤微生物在稻田 CH4的產生和排放中發(fā)揮著重要作用。稻田 CH4排放包括 CH4產生、再氧化和傳輸3個過程[3]，其中前兩個過程都與產甲烷菌和甲烷氧化菌數量及活性密切相關[5]。陳中云等[23]研究發(fā)現(xiàn)水稻田土壤的甲烷排放量受到甲烷氧化菌、產甲烷菌種群數量及其活性及土壤理化性狀的影響。結合筆者2011年在本原位試驗地所測得的稻季CH4排放數據(表2)[11]，我們發(fā)現(xiàn)稻田CH4排放量與土壤微生物豐度之間存在顯著相關性(表 3)。稻季不同生長季CH4排放量與相應階段的古菌和產甲烷菌數量之間均存在極顯著的正相關關系(P＜0.01)，這與以往研究結果一致[23-25]。因此，控制農田產甲烷菌可以有效減少CH4排放量。

表2 稻季CH4排放量Table 2 CH4 emission during the rice growing season

甲烷氧化菌生長在“通氣-厭氣”界面，可氧化CH4，消耗大量CH4[26-27]。本研究中稻季CH4排放量與甲烷氧化菌數量呈顯著正相關關系(表 3)。以往研究表明，土壤高濃度 CH4會促進甲烷氧化菌的生長和活性[28-29]。Zhang等[6]在本試驗地的研究表明，CH4產生潛勢對稻田 CH4排放量的影響較大，而 CH4氧化潛勢對其影響較小。本研究中，由于產甲烷菌數量的增加促進 CH4產生，而高濃度的CH4含量同時又促進甲烷氧化菌的生長，產甲烷菌數量增加對 CH4產生的促進作用強于甲烷氧化菌數量增加對 CH4氧化的促進作用，因此產甲烷菌與甲烷氧化菌的數量同時與CH4排放呈正相關關系。

表3 稻季CH4排放量與土壤微生物豐度的相關性Table 3 Correlation analysis of CH4 emissions and the abundance of soil microbial communities

3.2 間隙灌溉對稻季土壤產甲烷微生物豐度和結構的影響

隨著人們節(jié)水意識的提高，各種水稻節(jié)水灌溉技術，如“間隙灌溉”、“控制灌溉”“薄淺濕曬”等灌溉模式得到了大面積的推廣應用。前期淹水、中期烤田(通?？咎?～10 d)、后期干濕交替(約每周灌溉1 次、期間出現(xiàn)土面落干狀態(tài))至水稻收獲的間隙灌溉模式是一項廣泛推廣的農業(yè)措施。大量研究表明，相對于持續(xù)淹水，稻田烤田可顯著抑制水稻生長期CH4排放[6-8]，然而有關間隙灌溉模式對稻田土壤產甲烷微生物群落結構和功能影響的研究較少。本研究中土壤細菌、古菌、產甲烷菌和甲烷氧化菌的群落豐度均隨著間隙灌溉的進行和水稻的生長而處于動態(tài)變化中。Asakawa和Hayano[30]采用MPN法發(fā)現(xiàn)產甲烷菌的數量在整個稻麥生長季保持恒定；李大明等[25]研究發(fā)現(xiàn)在水稻生長旺盛期(分蘗期)產甲烷菌的數量顯著高于其他時期；而 Ma 等[31]通過研究不同水分管理方式對稻田產甲烷菌數量和結構發(fā)現(xiàn)，根際土壤中古菌的數量在水稻生長后期有明顯的增加，與持續(xù)淹水相比，干濕交替水分管理方式顯著降低稻田產甲烷菌數量，增加稻田甲烷氧化菌數量。本研究中稻季的水分管理參照當地稻田常規(guī)管理方式，采用前期淹水、中期烤田、后期干濕交替和末期排水落干的管理模式，為了有效控制水稻分蘗，烤田在水稻生長的旺期分蘗期進行。在淹水期，水稻正處于幼苗期，厭氧環(huán)境有利于產甲烷菌的生長；在烤田期，雖然水稻生長旺盛，但烤田增加了土壤通氣性，破壞了產甲烷菌的生存條件，產甲烷菌數量下降，達到最低值；隨著后期干濕交替的進行，產甲烷菌所需厭氧環(huán)境逐漸恢復，根系分泌物的大量產生又為產甲烷菌的增加提供了充足的反應底物，產甲烷菌數量逐漸增加，在水稻收獲前的落干期達到最大值。甲烷氧化菌數量隨著水稻生長而逐漸增加，在收獲前的落干期達到最大值，烤田對甲烷氧化菌的數量沒有顯著影響，這可能是由于烤田期土壤銨態(tài)氮大部分轉化為硝態(tài)氮，盡管烤田有利于甲烷氧化菌的生長，但硝態(tài)氮對甲烷氧化菌有一定的脅迫作用[32]。

水稻土中的產甲烷古菌群落主要由甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)，甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)，甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)，甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)和 RC-I，以及相當一部分在系統(tǒng)發(fā)育樹上沒有確定分類的種群[4]。本研究通過T-RFLP研究稻季土壤古菌群落組成和季節(jié)變化，結果表明，水稻生長季古菌群落優(yōu)勢片段是 184bp和391bp。Ma等[31]研究發(fā)現(xiàn)，水稻生長季內，水稻土產甲烷古菌群落結構非常穩(wěn)定，且不受間歇性排水的影響。Watanabe等[33]發(fā)現(xiàn)無論是在淹水狀況下的水稻種植期，還是干旱的小麥種植期，產甲烷古菌群落結構非常穩(wěn)定。而本研究CCA分析表明間隙灌溉顯著影響整個水稻生長季古菌群落結構，其中處于水稻生長前期的淹水期和烤田前期群落結構相似，但隨著烤田的進行和水稻的生長，古菌184bp的T-RF相對豐度逐漸下降，391bp的T-RF相對豐度逐漸上升。根據已有研究中古菌 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹[4]，184bp的T-RF通常代表乙酸發(fā)酵型產甲烷菌(Methanosarcinaceae)，391bp的 T-RF通常代表氫營養(yǎng)型產甲烷菌(RC-I)，表明水稻生長季內，乙酸型產甲烷菌相對豐度最高，隨著間隙灌溉的進行和水稻的生長，乙酸發(fā)酵型產甲烷菌相對豐度逐漸增加，而氫營養(yǎng)型產甲烷菌相對豐度逐漸下降。Penning等[34]培養(yǎng)實驗結果表明，隨著土壤有機質逐漸分解產生豐富的乙酸，則 CH4產生主要由乙酸發(fā)酵而來，隨著土壤中乙酸被大量消耗，乙酸發(fā)酵產甲烷途徑逐漸減弱，而H2/CO2還原產甲烷途徑逐漸增強。Zhang等[8]在本試驗地研究間隙灌溉下稻田CH4產生途徑的季節(jié)變化，結果表明，隨著間隙灌溉的進行，乙酸發(fā)酵產甲烷途徑由 70% 以上下降到 50% 左右。因此我們可以得到結論，水稻生長季內，乙酸發(fā)酵型產甲烷菌和氫營養(yǎng)型產甲烷菌相對豐度的變化決定了 CH4產生途徑的變化。

3.3 控釋肥施用對稻季土壤產甲烷微生物豐度和結構的影響

控釋肥作為一種新型肥料，不僅可以提高肥料利用率，有效防止環(huán)境污染，而且具有提高土壤酶活性、增加土壤微生物數量、降低環(huán)境污染等優(yōu)點[35]。孟慶英等[36]研究結果表明，施用肥料的各個處理土壤微生物數量均高于不施肥處理，其中控釋肥施用有利于增加土壤細菌、土壤氮素含量及玉米產量；羅蘭芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，短期施用控釋氮肥稻田土壤的細菌數量明顯高于不施氮處理，周年土壤細菌明顯高于尿素處理，土壤中大多數微生物數量與土壤氮素養(yǎng)分含量呈正相關。氮肥養(yǎng)分釋放特性不同，其對土壤中微生物數量及土壤中氮素產生影響不同[37]。本研究表明，與不施氮處理相比，施用尿素降低稻季收獲期細菌數量，而施用控釋肥增加其數量，這可能是由于尿素施用量過多會導致高濃度氮的脅迫作用和改變土壤pH，從而影響細菌的數量和活性，而控釋肥可調節(jié)養(yǎng)分釋放模式，滿足作物全生育期對氮的生理需求，更利于提高土壤氮素含量為微生物創(chuàng)造良好的生存環(huán)境，刺激微生物的生長和活性。

氮肥施用對土壤產甲烷菌和甲烷氧化菌的影響較為復雜。Schimel[38]研究表明氮促進植株生長，為CH4產生提供前體基質，從而促進產甲烷菌的生長和活性；而許靜等[39]研究表明高氮肥施用在一定程度上會抑制產甲烷菌的生長，降低其數量。本研究中，施用氮肥降低稻季古菌和產甲烷菌豐度，控釋肥的抑制作用小于尿素，這可能是由于尿素施用后通過硝化作用產生硝態(tài)氮，提升了土壤氧化還原電位，間接抑制產甲烷古菌的生長。銨態(tài)氮肥對土壤甲烷氧化菌的影響隨NH4+和CH4濃度的不同而變化[40]，本研究中，稻季生長前期，氮肥施用降低甲烷氧化菌數量，但稻季收獲期，氮肥施用增加其數量，這是由于在稻田高內源 CH4濃度的條件下，施用銨態(tài)氮肥對稻田 CH4氧化菌開始表現(xiàn)為抑制作用，隨著時間的延長和銨態(tài)氮的逐漸消失，高濃度 CH4和銨態(tài)氮的存在促進了甲烷氧化菌的生長[41]。以上分析表明稻季施氮處理降低CH4排放量(表2)主要是由于氮肥對產甲烷菌生長的抑制作用及其對水稻生長前期甲烷氧化菌生長的促進作用。水稻生長前期，與尿素相比，施用控釋肥對產甲烷菌和甲烷氧化菌數量沒有明顯影響，表3顯示尿素處理和控釋肥處理 CH4排放量之間無顯著差異，這進一步說明稻田 CH4排放量與產甲烷菌和甲烷氧化菌數量的顯著相關性。

研究表明，農業(yè)管理措施如施肥等會對土壤微生物產生重要的脅迫作用。長期以來，囿于培養(yǎng)方法，人們對土壤微生物多樣性特別是古菌和細菌多樣性所知甚少。近年來，國內外學者們結合DGGE和RFLP等分子標記技術研究了長期定位施肥對土壤產甲烷古菌和氨氧化古菌群落結構的影響[42]，但尚無關于控釋肥施用對稻季古菌群落結構影響的報道。Watanabe等[33]研究發(fā)現(xiàn)土壤中的產甲烷古菌主要受土壤類型的影響，而受土壤施肥制度與作物種植方式的影響相對較小，原因可能與產甲烷古菌主要介導了淹水土壤中丙酸鹽的厭氧氧化有關。本研究通過采用T-RFLP手段研究氮肥施用對水稻生長季土壤古菌群落結構的影響，得到與上述研究相似的結果，雖然在水稻生長季，古菌群落結構處于動態(tài)變化中，但控釋肥和尿素施用對土壤古菌群落結構沒有明顯影響。辜運富等[43]研究表明石灰性紫色土上種植水稻和小麥會對土壤中的古菌群落結構造成明顯影響，不同施肥制度對土壤古菌群落結構相似性具有明顯影響。目前有關施用無機肥對土壤微生物多樣性的影響報道存在矛盾之處，可能與無機肥的種類、施用量和施用時間長短、土壤類型和利用方式等因素有關。以往研究表明，控釋肥養(yǎng)分采用緩慢釋放的形式，改變了普通速溶肥料養(yǎng)分供應集中的特點，提高養(yǎng)分利用率的同時可減少施肥量，能減輕施肥對環(huán)境的污染[44]。本研究中控釋肥施用量與尿素施用量相同，在保證作物產量的前提下減少控釋肥施用量會對土壤微生物群落，尤其是功能微生物，產生不同的影響嗎？因此，有關控釋肥施用對土壤微生物群落結構和功能的影響仍需進一步研究。

4 結論

本研究通過采集水稻生長季田間原位試驗新鮮土樣，采用核酸定量技術和末端限制性片段長度多態(tài)性技術，研究間隙灌溉和控釋肥施用對稻田土壤產甲烷微生物群落豐度和結構的影響，以探討間隙灌溉和控釋肥施用影響稻田 CH4排放的微生物機理。結果表明，稻季CH4排放量與古菌、產甲烷菌(mcrA基因)和甲烷氧化菌(pmoA基因)數量均呈極顯著正相關關系，而與細菌數量無顯著相關性。在間隙灌溉水分管理方式下，稻田土壤產甲烷菌和甲烷氧化菌數量呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化，其中烤田抑制產甲烷菌生長，而對甲烷氧化菌數量沒有顯著影響。與尿素相比，施用控釋肥增加了稻田土壤細菌、古菌和產甲烷菌數量，降低了甲烷氧化菌數量。土壤古菌群落的優(yōu)勢 T-RFs長度為184bp和391bp，其中184bp片段的相對豐度隨著間隙灌溉的進行逐漸降低為主，而391bp片段逐漸增加。CCA分析表明間隙灌溉顯著影響土壤古菌

群落結構，而控釋肥施用對土壤古菌群落結構沒有明顯影響。

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