張鶴山，劉 洋，田 宏，熊軍波，蔡 化

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所／動物胚胎規(guī)程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢430064）

鋁是地殼中儲量最大的金屬元素之一，約占地殼元素總量的7%。通常，在中性的土壤中鋁不會對植物造成影響，但在酸性環(huán)境中（p H值＜5），毒性較大的活性鋁便會從土壤中析出，對植物造成危害。研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤中作物產(chǎn)量的下降和森林的毀滅都和鋁毒害有直接關(guān)系［1］，鋁毒害已成為酸性土壤植物生長的主要限制因素［24］。我國酸性土壤主要是紅壤，分布在南方15個省區(qū)，總面積為2 030萬hm2，占全國土地總面積的21%［5］。近年來，隨著酸雨的頻繁發(fā)生以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中酸性肥料的大量施用，使得土壤的酸度進一步增強［6］，造成土壤中鋁毒害加劇。酸性土壤中的鋁毒害已成為制約我國紅壤區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。生產(chǎn)上也有通過在酸性土壤中施用石灰或其他堿性物質(zhì)來治理鋁毒害的措施，但生產(chǎn)成本太大，并且長期施用會破壞土壤理化結(jié)構(gòu)，影響生態(tài)平衡。因此，從長遠看，鑒定篩選耐鋁作物種質(zhì)材料，培育作物新品種是一種經(jīng)濟、有效的措施［78］。

蕎麥（Fagopyrum.esculentumMoench）為蓼科蕎麥屬雙子葉植物，是我國重要的糧食作物，也是很好的藥用植物［9］。蕎麥耐鋁性強，常作為酸性土壤上的改良植物［1011］。研究表明，不同蕎麥品種對鋁毒害的反應(yīng)各異，它們的耐鋁性也有差異［12］。因此，通過耐鋁性鑒定篩選強耐鋁性的品種或種質(zhì)資源，對于蕎麥的推廣利用和耐鋁性新品種選育具有重要意義。本試驗擬以40份蕎麥材料為研究對象，通過鋁脅迫處理，測定其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度和胚芽長度等指標(biāo)，研究不同濃度鋁脅迫對蕎麥芽期萌發(fā)特性的影響，并對40份材料進行耐鋁性綜合評價，為蕎麥的抗性評價及新品種培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自湖北地區(qū)野外收集的蕎麥種質(zhì)，共40份（自Q 1至Q 40按順序編號）。

1.2 試驗方法

脅迫處理為不同Al3＋濃度溶液，p H值4.5。試驗設(shè) Al3＋濃度為0.01，0.1 mol／L和0.5 mol／L 3個濃度梯度，以HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液酸度維持p H值4.5。對照為不加鋁溶液的去離子水。

將種子用0.1%HgCl2表面消毒5 min，蒸餾水沖洗干凈，放在鋪有2層濾紙的潔凈培養(yǎng)皿中，每個處理4次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子，分別加入15 m L處理溶液。于人工氣候箱進行變溫培養(yǎng)（25℃，16 h，光照／18℃，8 h，黑暗）。逐日（每天固定時間觀測）觀察記載發(fā)芽種子數(shù)，以胚根長度超過2 mm視為發(fā)芽，試驗過程中不再加入其他任何溶液。

1.3 測定指標(biāo)

1）發(fā)芽率：從放入種子即日起至第7天終止，統(tǒng)計正常發(fā)芽種子粒數(shù)占供試種子總數(shù)的百分率。

即發(fā)芽率（%）＝N0／N×100%（式中，N0為發(fā)芽終期全部發(fā)芽的種子數(shù)；N為供試種子數(shù)）。

2）發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑Gt／Dt（式中，Gt為日發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)）。

3）胚芽長度：隨機取20個正常生長的幼苗，用直尺分別測幼苗長度（cm），取平均值作為胚芽長度。

4）胚根長度：隨機取20個正常生長的幼苗，用直尺分別測幼苗的根長（cm），取平均值作為胚根長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Al3＋脅迫對發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響

在Al3＋脅迫下，不同蕎麥種質(zhì)表現(xiàn)出不同的發(fā)芽特性（表1）。在0.01～0.5 mol／L Al3＋濃度脅迫下，Q 8、Q 15、Q 21和Q 29等4份種質(zhì)表現(xiàn)出較強的發(fā)芽能力，其發(fā)芽率相對于對照有所提高或保持不變；在0.01～0.1 mol／L Al3＋濃度下，Q 1、Q 3～Q 5、Q 7～Q 9、Q 11、Q 14～Q 16、Q 18、Q 22、Q 24、Q 25、Q 27、Q 29、Q 31、Q 33和Q 40等20份種質(zhì)發(fā)芽率均為100%，而種質(zhì) Q 13、Q 17、Q 20、Q 21、Q 23、Q 28、Q 32、Q 35～Q 39更是表現(xiàn)出發(fā)芽率提高的現(xiàn)象，但在0.5 mol／L Al3＋濃度時所有這些種質(zhì)的發(fā)芽率明顯降低。從發(fā)芽率增減幅度看，在0.01 mol／L Al3＋濃度下，種質(zhì)發(fā)芽率增減幅度為－5.4%～44.7%，其中種質(zhì)Q 38發(fā)芽率提高44.7%，而種質(zhì)Q 10發(fā)芽率降低5.4%；在0.1 mol／L Al3＋濃度下，種質(zhì)發(fā)芽率增減幅度為－5.0%～26.9%，其中種質(zhì) Q 38發(fā)芽率提高26.9%，而種質(zhì) Q 39發(fā)芽率降低5.0%；在0.5 mol／L Al3＋濃度下，種質(zhì)發(fā)芽率顯著降低，其增減幅度為－52.5%～0.9%，其中種質(zhì) Q 12發(fā)芽率提高0.9%，而種質(zhì)Q 39發(fā)芽率降低52.5%。由此可見，在試驗設(shè)計Al3＋濃度下，多數(shù)蕎麥種質(zhì)仍表現(xiàn)出較強的耐受鋁脅迫能力，具有較高發(fā)芽率。進一步的方差分析結(jié)果（表2）表明，在0.01 mol／L和0.1 mol／L Al3＋濃度下，發(fā)芽率與對照不存在顯著差異，但在0.5 mol／L濃度下，發(fā)芽率顯著下降，并且與對照和其他2個處理差異達極顯著水平（p＜0.01）。

表1 不同Al3＋濃度脅迫下各指標(biāo)測定結(jié)果

發(fā)芽指數(shù)是表示種子萌發(fā)特性的又一重要指標(biāo)，反映了種子發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊度和幼苗健壯的潛勢。本研究結(jié)果（表1）表明，多數(shù)參試材料發(fā)芽指數(shù)隨Al3＋濃度的增加呈下降趨勢，但種質(zhì) Q 15、Q 20、Q 21、Q 28、Q 35、Q 37、Q 38和Q 39隨Al3＋濃度的增加呈先升后降的變化趨勢。在不同Al3＋濃度脅迫下，種質(zhì)所受影響程度亦不同。相比于對照處理，在0.01 mol／L Al3＋濃度下，種質(zhì)發(fā)芽指數(shù)增減幅度為－14.5%～45.5%，在0.1 mol／L Al3＋濃度和0.5 mol／L Al3＋濃度下其增減幅度分別為－24.4%～23.4%和－78.9%～－50.5%?？?見，當(dāng) Al3＋濃度達到 0.5 mol／L時，種質(zhì)的發(fā)芽指數(shù)出現(xiàn)顯著下降。方差分析（表2）表明，在0～0.1 mol／L Al3＋濃度范圍內(nèi)，不同處理間發(fā)芽指數(shù)沒有顯著差異，但0.5 mol／L Al3＋濃度處理顯著降低了種質(zhì)發(fā)芽指數(shù)，且差異達極顯著水平（p＜0.01）。

2.2 不同Al3＋濃度對胚根長度和胚芽長度的影響

不同Al3＋濃度脅迫下，各蕎麥種質(zhì)胚根長度和胚芽長度見表1。相對于發(fā)芽率對Al3＋脅迫的強耐受性，胚根的生長發(fā)育對Al3＋脅迫更為敏感。在0.01 mol／L Al3＋濃度處理下，所有種質(zhì)的胚根長度顯著減小，長度僅為對照處理的2.5%～38.0%，在0.5 mol／L Al3＋濃度時所有種質(zhì)的胚根生長受到嚴重抑制，胚根無法生長。Al3＋脅迫可顯著抑制蕎麥胚根的生長發(fā)育，隨著Al3＋濃度的增加這種脅迫更加明顯。0.01 mol／L Al3＋濃度處理下所有材料平均胚根長度為0.76 cm，僅為對照的10.4%，且與對照差異達極顯著水平（p＜0.01）；0.1 mol／L Al3＋濃度處理下胚根平均長度為0.34 cm，為對照的4.7%，與對照差異達極顯著水平（p＜0.01），但與0.01 mol／L Al3＋濃度處理差異不顯著（表2）。

同樣，胚芽的生長也受Al3＋脅迫的影響（表1），但在同一Al3＋濃度下其所受抑制程度較胚根被抑制程度輕。在0.01 mol／L時，Al3＋脅迫反而促進了 Q 20、Q 21、Q 22和Q 28等種質(zhì)胚芽的生長，其長度分別比對照增加2.4%、19.9%、18.6%和0.8%；在0.1 mol／L時所有種質(zhì)胚芽生長受到抑制，其長度為對照的24.6%～100.0%；在0.5 mol／L 時，所有種質(zhì)不能發(fā)芽。方差分析（表2）表明，0.01 mol／L Al3＋處理和0.1 mol／L Al3＋處理下胚芽長度分別為2.89 cm 和1.87 cm，分別為對照的74.7%和48.2%，且與對照差異達極顯著水平（p＜0.01）。

表2 不同Al3＋濃度脅迫對蕎麥各指標(biāo)的影響

2.3 耐鋁性綜合評價

2.3.1 級別值確立

本研究采用5級評價法，對各指標(biāo)值進行分級，使每一指標(biāo)具有對應(yīng)的級別值，這樣各性狀因數(shù)值大小和變化幅度的不同而產(chǎn)生的差異即可消除，其換算公式如下：

式中，X jmax為第j個指標(biāo)測定的最大值；X jmin為第j個指標(biāo)測定的最小值；X ij為第i份材料第j項指標(biāo)測定的實測值；λ為得分極差（每得1分之差）；Z ij為第i份材料第j項指標(biāo)的級別值。

2.3.2 權(quán)重系數(shù)建立

為了減少因種質(zhì)材料本身品質(zhì)差異所造成的誤差，本研究利用每一測定指標(biāo)的相對值進行評價，其相對值計算公式為：

由于蕎麥各指標(biāo)對不同鋁脅迫的耐受性不同，為了更好地體現(xiàn)不同種質(zhì)間的差異，研究利用每個指標(biāo)中變異系數(shù)最大的處理作為本評價方法的原始評價數(shù)據(jù)。經(jīng)統(tǒng)計，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)在0.5 mol／L濃度處理時具有更大的變異系數(shù)，分別為15.2%和16.8%；而胚根長度和胚芽長度在0.1 mol／L濃度處理時具有最大變異系數(shù)，分別為98.9%和28.9%。由公式（3）可計算出發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度、胚芽長度4個指標(biāo)參與綜合評價的權(quán)重系數(shù)分別為0.096、0.105、0.617和0.182。

式中，W j為第j項指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)；δj為第j項指標(biāo)的變異系數(shù)。

2.3.3 綜合評價值

綜合評價值的大小反映了種質(zhì)間的耐鋁性差異，其計算公式為：

式中：V i為每一份材料的綜合評價值，Z ij為各測定值的級別值，W j為對應(yīng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。

利用公式（4）得出，各種質(zhì)耐鋁性綜合評價值（見表3）。由表3可知，在0～5分的范圍內(nèi)，有34份種質(zhì)綜合評分在1～3分之間，說明多數(shù)蕎麥種質(zhì)耐鋁性處于中等水平；但種質(zhì)Q 24的評價分值明顯高于其他種質(zhì)，為4.36，屬于強抗逆型。得分低于1分的種質(zhì)有Q 34、Q 35、Q 36、Q 38和Q 39，它們對鋁脅迫耐受性較差，其中種質(zhì)Q 39的綜合評價值僅為0.49。

3 討論與結(jié)論

1）發(fā)芽率是體現(xiàn)種子萌發(fā)特性的重要指標(biāo)。蕎麥?zhǔn)潜容^耐鋁脅迫的植物［13］，低濃度鋁脅迫對其發(fā)芽率影響較低，在一定范圍內(nèi)（10 mg／L和100 mg／L）還可提高蕎麥發(fā)芽率［14］；南益麗發(fā)現(xiàn)，低于2 000 mg／L濃度的鋁脅迫可以促進蕎麥種子萌發(fā)［15］。本研究結(jié)果表明，不同蕎麥種質(zhì)對鋁脅迫的反應(yīng)不同，試驗中有24份種質(zhì)在低濃度（0.01 mol／L）Al3＋脅迫下發(fā)芽率有提高趨勢，但也有16份種質(zhì)隨Al3＋濃度增加發(fā)芽率增減降低。由此可見，盡管蕎麥具有較強的耐鋁能力，但不同蕎麥種質(zhì)對鋁脅迫表現(xiàn)出不一樣的萌發(fā)特性，這一特性有助于篩選優(yōu)異耐鋁蕎麥種質(zhì)，為蕎麥抗逆性育種提供基礎(chǔ)材料。

2）胚根和胚芽的生長發(fā)育是體現(xiàn)種子萌發(fā)的又一重要指標(biāo)。許多研究表明，鋁脅迫對蕎麥根系的影響最大，在100 mg／L鋁脅迫下根系即受到顯著抑制，與對照差異顯著［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)，0.01 mol／L Al3＋濃度即可嚴重抑制蕎麥根系生長，其胚根長度僅為對照的2.5%～38.0%，說明蕎麥根系對鋁脅迫比較敏感，是評價篩選耐鋁性蕎麥種質(zhì)材料的重要指標(biāo)。同樣，胚芽的生長發(fā)育也受鋁脅迫的影響，但在不同Al3＋濃度下，不同的種質(zhì)表現(xiàn)也不同，低濃度（0.01 mol／L）的Al3＋脅迫可以促進部分蕎麥胚芽生長，但高濃度（＞0.1 mol／L）處理顯著抑制蕎麥胚芽生長。由此可見，相對于胚芽生長，蕎麥根系對Al3＋脅迫更為敏感。

表3 各材料級別值及耐鋁性綜合評價值

3）評價植物的耐鋁性有多種方法，包括量取根的伸長、測定根尖鋁含量以及評價生物量等［1618］，由于鋁對植物毒害作用最明顯的特征就是抑制根伸長，因此常被用來衡量植物受到鋁毒害程度的參數(shù)［19］。本研究以鋁脅迫下的蕎麥的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度和胚芽長度作為綜合評價指標(biāo)，可以較為全面地反映不同蕎麥種質(zhì)的萌發(fā)特性，對于耐鋁性蕎麥種質(zhì)的篩選具有重要意義。結(jié)果表明，參試的40份蕎麥種質(zhì)多數(shù)屬于中等耐鋁水平，1份屬于強耐鋁水平，屬于弱耐鋁的材料有5份。盡管如此，蕎麥種質(zhì)資源的耐鋁性鑒定涉及指標(biāo)多，過程復(fù)雜，尋找更簡單有效的評價方法是研究者下一步的工作重點。

［1］Von Uexkull H R，Mutert E.Global extent development and economic of acid soils［J］.Plant Soil，1995（1）：115.

［2］Delhaize E，Ryan P R.Aluminum toxicity and tolerance in plants［J］.Plant Physiology，1995，107：315321.

［3］Kochian L V.Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants［J］.Annual Review Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1995，46：237260.

［4］Foy C D，Chaney R L，White M S.The physiology of metal of toxicity in plants［J］.Plant Physiol，1978，29：511566.

［5］劉強，鄭紹建，林咸永.植物適應(yīng)鋁毒脅迫的生理及分子生物學(xué)機理［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2004，15（9）：1 6411 649.

［6］翁建華，黃連芬，劉曉茹.土壤酸化及天然土壤中鋁的形態(tài)［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2000，20（6）：501505.

［7］王芳，劉鵬，徐根娣，等.鋁對蕎麥生理影響的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2005，24（4）：678681.

［8］王芳，劉鵬，徐根娣，等.鋁對蕎麥根系的影響［J］.廣西植物，2006，26（3）：321324.

［9］趙鋼，唐宇，王安虎，等.中國的蕎麥資源及其藥用價值［J］.中國野生植物資源，2001，5（2）：3639.

［10］Ma J F，Zhang S J，Matsumoto H.Detoxifying aluminum with buckwheat［J］.Nature，1997，390：569570.

［11］林咸永，章永松，陶勤南.鋁脅迫下不同小麥基因型根際p H的變化、和吸收及還原與其耐鋁性的關(guān)系［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2002，8（3）：330334.

［12］Peng X X，Yu L，Yang C，et al.Genotypic difference in aluminum resistance and oxalate exudation of buckwheat［J］.Journal of Plant Nutrition，2003，26：1 7671 777.

［13］Pineros M A，Magalhaes J V，Carvalho A V M，et al.The physiology and biophysics of an aluminum tolerance mechanism based on root citrate exudation in maize［J］.PlantPhysiology，2002，129：1 1941 206.

［14］李朝蘇，劉鵬，徐根娣，等.酸鋁浸種對蕎麥種子萌發(fā)的影響［J］.種子，2004，23（12）：911.

［15］南益麗，陳利，劉鵬，等.鋁對蕎麥種子萌發(fā)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（22）：5 7885 789，5 827.

［16］Samac D A，Tesfaye M.Plant improvement for tolerance to aluminum in acid soilsa review［J］.Plant Cell Tiss.Org.Cult.，2003，75：189207.

［17］林咸永，章永松，羅安程.不同小麥基因型耐鋁性的差異及篩選方法的研究［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2001，7（1）：6470.

［18］萬延慧，年海，嚴小龍.大豆種質(zhì)耐低磷與耐鋁毒部分指標(biāo)及其相互關(guān)系的研究［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2001，7（2）：199204.

［19］Kochian L V，Pineros M A，Hoekenga O A.The physiology，genetics and molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity［J］.Plant Soil，2005，46：237260.