余 馬，左文松，劉 茹，徐冬梅，舒曉燕，唐志康，侯大斌

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng)621010； 2.瀘州市古藺縣農(nóng)業(yè)局，四川 瀘州646500）

柴胡（Radix Bupleuri）為我國(guó)、日本和韓國(guó)等亞洲國(guó)家使用的常用大宗藥材。該藥材常同其他藥物結(jié)合治療感冒發(fā)熱、寒熱虛勞發(fā)熱、小兒痘疹余熱、腹部膨大、肝郁氣滯、胸肋脹痛、脫肛、子宮脫落及月經(jīng)不調(diào)等癥［12］。目前，柴胡已被納入中國(guó)和日本國(guó)家藥典，同時(shí)在中國(guó)和韓國(guó)被世界衛(wèi)生組織列為常用藥用植物［34］。因?yàn)槠渲匾乃幱脙r(jià)值，柴胡需求量急劇增加。在中國(guó)，柴胡年均需求量已過(guò)8 000 t；在日本市場(chǎng)2002年售出含有柴胡的處方藥總額達(dá)到270億日元［56］。近年來(lái)，野生柴胡的資源蘊(yùn)藏量由于掠奪式開采急劇下降，且野生柴胡資源存在來(lái)源地不明和種質(zhì)混雜導(dǎo)致藥效不穩(wěn)定及藥材市場(chǎng)混亂的弊端，因此工業(yè)化柴胡栽培生產(chǎn)顯得尤為重要。

目前柴胡規(guī)模化栽培采用種子直播方式。與主要作物相比，柴胡馴養(yǎng)歷史較短，很多性狀不利于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)種植，特別是柴胡種子萌發(fā)時(shí)對(duì)土壤水分含量非常敏感，在田間萌發(fā)率低和出苗不整齊等問(wèn)題嚴(yán)重阻礙柴胡大規(guī)模栽培。此外，柴胡為異花授粉植物，后代產(chǎn)量性狀和有效成分變異概率較高［7］。組織培養(yǎng)可以在短時(shí)間內(nèi)大量獲得性狀一致的植株，為工業(yè)化次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)提供材料基礎(chǔ)。且柴胡資源搜集工作中，植株移栽不易成活。高雨量地區(qū)柴胡授粉結(jié)實(shí)較少，搜集難度極大，亟待開發(fā)系統(tǒng)的柴胡組織培養(yǎng)體系，為柴胡資源搜集工作提供技術(shù)保障。本研究以北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）新品種川北柴1號(hào)為材料。對(duì)其進(jìn)行不同生長(zhǎng)激素的叢生芽誘導(dǎo)及不定根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，以期探索出適宜北柴胡快速繁育的組織培養(yǎng)體系，為柴胡新資源搜集工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用的主要研究對(duì)象為北柴胡新審定品種川北柴1號(hào)。該品種系中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院及西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院共同選育。供試植株于2014—2015年種植于四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司安縣花罧基地。田間設(shè)計(jì)采用撒播，種植密度為2 000株／hm2，常規(guī)肥水管理及病蟲害防治。

1.2 北柴胡叢生芽誘導(dǎo)

以北柴胡未拔節(jié)的幼嫩莖段為外植體。外植體消毒條件為：帶葉莖段取樣后去掉葉片，流水沖洗2 h。取出莖段后70%乙醇消毒50 s，0.1%升汞消毒10 min后滅菌水清洗10次。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基添加6 g瓊脂粉和30 g蔗糖，p H值控制在5.8～6.0。采用6BA、KT、NAA、IAA 4種調(diào)節(jié)激素，每種激素設(shè)置3個(gè)濃度水平（表1）。各激素間協(xié)同效應(yīng)采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表2）。單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)均設(shè)置不添加生長(zhǎng)激素的空白對(duì)照組。設(shè)置3次重復(fù)。光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)置為：培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，日光照時(shí)間14 h。外植體培養(yǎng)30 d后進(jìn)行性狀考查。

1.3 柴胡不定根誘導(dǎo)

從誘導(dǎo)的叢生芽中切取長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的單個(gè)芽為外植體。以1／2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，瓊脂粉、蔗糖濃度及p H值同叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)一致。采用NAA、IBA和IAA 3種調(diào)節(jié)激素，每種條件設(shè)置3個(gè)濃度（表3）。各激素間對(duì)不定根誘導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表4）。單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)均設(shè)置不添加生長(zhǎng)激素的空白對(duì)照組。設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)一致，不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后進(jìn)行性狀考查。

表1 叢生芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中的激素及濃度

表2 不定根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中的激素及濃度

1.4 性狀考查

叢生芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)考查性狀包括：叢生芽個(gè)數(shù)、芽長(zhǎng)、葉綠素、鮮重、干重。不定根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)考查性狀包括：支根數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素含量、節(jié)長(zhǎng)、鮮重、干重。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

方差分析采用SPSS 16.0分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽誘導(dǎo)

圖1 單因素誘導(dǎo)柴胡叢生芽

不添加任何激素對(duì)照的柴胡外植體生長(zhǎng)3 d后，僅長(zhǎng)出極少不定芽。6BA、KT、NAA、IAA 4種激素的不同水平對(duì)誘導(dǎo)川北柴1號(hào)叢生芽均具有顯著正向效應(yīng)（p＜0.05，表3）。各因素的3個(gè)濃度水平誘導(dǎo)柴胡叢生芽，芽個(gè)數(shù)、芽長(zhǎng)、鮮重和干重、葉綠素含量的差異較大。綜合各性狀的測(cè)定結(jié)果，誘導(dǎo)柴胡叢生芽增殖效果的最佳6BA濃度為1.0 mg／L，其誘導(dǎo)不定芽個(gè)數(shù)達(dá)到7個(gè)，所誘導(dǎo)不定芽的芽長(zhǎng)、鮮重、干重及葉綠素含量均顯著高于0.5 mg／L 的6BA、1.5 mg／L 的6BA和空白對(duì)照誘導(dǎo)結(jié)果（圖1）。誘導(dǎo)叢生芽效果的最佳KT濃度為0.5 mg／L，該濃度處理下誘導(dǎo)出7個(gè)不定芽，其誘導(dǎo)不定芽鮮重、干重及葉綠素含量顯著高于對(duì)照。誘導(dǎo)叢生芽效果的最佳NAA濃度為0.2 mg／L，該濃度處理下誘導(dǎo)出7個(gè)不定芽，其誘導(dǎo)不定芽的所有考查性狀皆高于對(duì)照。誘導(dǎo)叢生芽效果的最佳IAA濃度為1.0 mg／L，其誘導(dǎo)不定芽鮮重和干重顯著高于對(duì)照，芽長(zhǎng)和葉綠素含量與對(duì)照差異不明顯。

表3 植物生長(zhǎng)激素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不定根誘導(dǎo)

不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)中，剝離不定芽在不添加任何生長(zhǎng)激素的1／2 MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)很弱，其生長(zhǎng)30 d后未長(zhǎng)出不定根，且葉片變細(xì)弱，其葉綠素含量?jī)H為4.3。NAA、IBA、IAA 3種激素的不同水平對(duì)誘導(dǎo)川北柴1號(hào)不定根均具有正向效應(yīng)（表4）。各因素的3個(gè)濃度水平誘導(dǎo)柴胡不定根，根個(gè)數(shù)、根長(zhǎng)、根鮮重和干重、葉綠素含量的差異較大。其中NAA誘導(dǎo)試驗(yàn)中，0.1 mg／L濃度NAA誘導(dǎo)不定根數(shù)達(dá)到45，除不定根平均根長(zhǎng)外，其誘導(dǎo)不定根其余性狀皆顯著高于0.3 mg／L和0.5 mg／L濃度NAA誘導(dǎo)結(jié)果。IBA誘導(dǎo)試驗(yàn)中，1.0 mg／L濃度IBA誘導(dǎo)不定根數(shù)達(dá)到34，除根長(zhǎng)與0.5 mg／L濃度IBA誘導(dǎo)效果差異不顯著外，其余考查性狀皆顯著高于0.1 mg／L和0.5 mg／L濃度IBA誘導(dǎo)效果。IAA誘導(dǎo)試驗(yàn)中，1.0 mg／L濃度IAA誘導(dǎo)不定根數(shù)量最多，達(dá)到18個(gè)，顯著高于0.1 mg／L和0.5 mg／L濃度IAA誘導(dǎo)結(jié)果。

表4 植物生長(zhǎng)激素對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響

3 討論與分析

柴胡是常用大宗藥材，因此柴胡屬植物的組培相關(guān)報(bào)道較多。Fraternale等［7］研究并報(bào)道了誘導(dǎo)三島柴胡（B.fruticosum）芽增殖和不定根生長(zhǎng)的組培體系。Chen等［8］建立提升高氏柴胡（B.kaoi）芽誘導(dǎo)系數(shù)的組培體系，并對(duì)組培過(guò)程中小苗抗性提升做了系統(tǒng)研究。北柴胡是《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部規(guī)定正品柴胡，因此關(guān)于北柴胡組培研究的報(bào)道也較多。Hao等［9］建立了北柴胡愈傷組織誘導(dǎo)體系。Yao等研究表明，在黑暗條件下利用IAA誘導(dǎo)北柴胡愈傷組織可以產(chǎn)生大量不定根［10］。Hao等［11］通過(guò)控制蔗糖濃度及添加時(shí)間等方式建立了可以產(chǎn)生大量北柴胡不定根的半連續(xù)組培體系。對(duì)我國(guó)山西、甘肅和陜西等北方柴胡產(chǎn)區(qū)收獲北柴胡的組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)區(qū)收獲北柴胡組織培養(yǎng)條件存在特異性，因此探索適應(yīng)特定柴胡基因型的組織培養(yǎng)體系非常必要［12］。

四川省青川縣馬公及周邊地區(qū)野生柴胡資源豐富，分布較廣，已有300多年種植歷史，是柴胡的著名道地產(chǎn)區(qū)。川北柴1號(hào)系四川首個(gè)北柴胡審定新品種，該品種在多年多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn)中較四川地方栽培種及中國(guó)主要柴胡品種中柴1號(hào)表現(xiàn)出顯著產(chǎn)量及藥效品質(zhì)。目前川北柴1號(hào)在四川推廣面積達(dá)330 hm2以上，生產(chǎn)用種供不應(yīng)求，亟需開展適應(yīng)該品種的組織培養(yǎng)體系以滿足生產(chǎn)制種需要。

本研究通過(guò)不同種類及濃度的生長(zhǎng)激素研究表明：在 MS培養(yǎng)基中，1.0 mg／L的6BA，0.5 mg／L的 KT，0.2 mg／L的NAA和1.0 mg／L的IAA在顯著促進(jìn)不定芽增殖的同時(shí)，還能最大化促進(jìn)不定芽生長(zhǎng)；在1／2 MS培養(yǎng)基中，0.1 mg／L濃度 NAA，1.0 mg／L濃度IBA 和1.0 mg／L濃度IAA對(duì)柴胡不定根生長(zhǎng)促進(jìn)作用最佳。為研究各生長(zhǎng)激素間協(xié)同效應(yīng)，本課題組在叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)及不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)中針對(duì)所有供試生長(zhǎng)激素進(jìn)行了3個(gè)濃度水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。但可能實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)（重復(fù)設(shè)置為3）過(guò)低，各生長(zhǎng)激素貢獻(xiàn)效應(yīng)并不顯著，因此更大規(guī)模的組織培養(yǎng)試驗(yàn)正在進(jìn)行中。本研究已獲得的組培體系中，芽增殖系數(shù)每30 d即可達(dá)到1∶9，一年即可達(dá)到1∶2.8×1011，本研究對(duì)川北柴1號(hào)生產(chǎn)推廣制種具有重大意義。

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