宋吉軒， 李 云， 李 標， 鄧仁菊， 李 麗

（貴州省生物技術研究所， 貴陽550006）

甘薯屬旋花科甘薯屬一年生作物，由于塊根產量高、適應性廣，是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及生物能源作物之一。而紫心甘薯薯肉一般為紫色或深紫色，除含有普通甘薯各種營養(yǎng)成分外，還富含有豐富的花青素，由于花青素具有特殊的功能，從而表現(xiàn)出一些特有的生理活性和功能［1］。有研究表明，紫心甘薯具有抗氧化、保肝和改善視力等功能，同時還能降低血清中的相關酶，對高血壓等心血管病有較好的預防功能［1－2］。

ISSR分子標記在作物種質資源鑒定、分類及親緣關系分析等中有重要的應用，對研究材料的背景要求不嚴，且具有引物設計簡單、多態(tài)性高、重復性好和結果可靠等優(yōu)點［3］，在一些作物種質資源鑒定和親緣關系研究中進行了相應的應用［4－5］。同時，ISSR分子標記在甘薯遺傳多樣性等方面獲得了肯定，并有較高的分辨力［6］。目前利用ISSR分子標記分析貴州紫心甘薯種質資源的遺傳多樣性還未見報道。本研究利用ISSR分子標記對23份貴州紫心甘薯種質資源的親緣關系進行分析，初步了解紫心甘薯材料間的親緣關系，為貴州省選育紫心甘薯新品種，提高育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗材料為引進和新選育的貴州紫心甘薯種質資源，一共23份（見表1）。

表1 23份貴州紫心甘薯種質資源

1.2 方 法

1.2.1 紫心甘薯基因組DNA的提取

紫心甘薯種質資源基因組DNA的提取［7］，獲得的基因組DNA溶液的質量可達到ISSR分子標記要求。

1.2.2 ISSR－PCR反應與電泳檢測

ISSR－PCR的反應體系、擴增參數(shù)和電泳檢測［8］。反應體系：采用20μL體系，Taq 酶（1U／L）0.2μL，10×buffer 2μL，甲 酰 胺 （1%）1μL，dNTP（0.3mmol／L）：0.6μL，引 物（1U）2μL，DNA模板（45ng／μL）：2μL，加水補至20μL；擴增參數(shù)：94℃充分變性5min，然后40個循環(huán)：94℃變性90s，50～60℃退火45s，72℃延伸7min，最后72℃延伸8min，4℃終止反應；電泳檢測：取PCR擴增產物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上進行，需45min左右，以DL 2 000作為標記，電泳完后進行照像保存，方便下一步讀取條帶。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

以瓊脂糖電泳的每條DNA帶為1個單位，有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，應用Excel進行數(shù)據(jù)輸入，統(tǒng)計結果為0～1型的數(shù)據(jù)，然后利用DPS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理并聚類分析。

2 結果與分析

2.1 紫心甘薯種質資源的ISSR結果

通過從15個ISSR引物中最終篩選出7個多態(tài)性好且條帶清晰的ISSR引物［9］。利用篩選出的7個引物一共擴增出45個條帶，每個引物平均擴增出6.5個條帶，其多態(tài)性帶為41個，多態(tài)性百分數(shù)達到91.1%。其中，引物825、835和引物841對23份貴州紫心甘薯種質的ISSR－PCR擴增結果見圖1～圖3。

2.2 ISSR聚類分析

通過DPS統(tǒng)計軟件對23份貴州紫心甘薯種質資源進行了聚類分析，所獲得的聚類圖結果見圖4。

23份貴州紫心甘薯種質資源的遺傳相似系數(shù)范圍為0.07～0.62，平均值為0.32，表明23份貴州紫心甘薯種質資源的親緣關系比較接近，黔紫薯1號和13－4－1的最大，為0.62；13－32－36和13－27－5的最小，為0.07。

由圖4可知，ISSR分子標記產生的聚類圖將23份貴州紫心甘薯種質資源分為5大類群，第1類為13－4－1、13－24－2、13－26－3、13－27－6、13－27－1、13－4－2、13－19－3、13－24－2、13－27－5、13－32－36、13－34－15、13－34－22、徐紫1號和徐紫糯共15份；第2類為13－24－1、13－27－2、濟 薯 18 和 13－32－38 等 共 4 份；第 3 類 為13－35－16和寧紫薯1號共2份；13－32－35和黔紫薯1號分別為第4類和第5類，都只有1份。

圖1 23份貴州紫心甘薯種質資源的擴增結果（引物：825）

圖2 23份貴州紫心甘薯種質資源的擴增結果（引物：835）

圖3 23份貴州紫心甘薯種質資源的擴增結果（引物：841）

其 中 13－4－1 與 13－24－1、13－32－35、13－35－16、福薯9號和黔紫薯1號的歐式距離達0.4以上，最高達0.62。在今后貴州省紫心甘薯新品種選育工作中，應引進一些遺傳相似系數(shù)較大即親緣關系較遠的紫心甘薯種質資源進行親本組配，可選育出性狀優(yōu)異的雜交后代。

3 討 論

ISSR分子標記具有不受取材、時間及人為限制等優(yōu)點，這是傳統(tǒng)的形態(tài)標記無法相比的。李強等研究表明，利用ISSR分子標記采用17個引物分析62份甘薯親本材料的遺傳多樣性，一共檢測出490條多態(tài)性的條帶，表明ISSR分子標記是甘薯遺傳多樣性分析的可行有效的手段［10］。賀學勤等研究表明，RAPD、ISSR和AFLP這3種分子標記都可明晰甘薯品種間的親緣關系，但ISSR分子標記的聚類分析圖與系譜圖最相近，所以ISSR分子標記更合適用于甘薯品種親緣關系的分析［11］。本研究結果與前人的基本一致，說明ISSR分子標記的穩(wěn)定性較好，多態(tài)性高，達到91.1%，最后通過瓊脂糖凝膠電泳結果表明，出現(xiàn)的條帶也是較豐富的。

國內紫心甘薯種質資源數(shù)量有限，本實驗僅對23份貴州紫心甘薯種質資源進行ISSR分析。結果表明，15個ISSR引物中最終篩選出7個多態(tài)性好且條帶清晰的ISSR引物，這些篩選出的引物最終共擴增出45個條帶，每個引物平均擴增出6.5個條帶，其多態(tài)性帶為41個，多態(tài)性百分數(shù)達到91.1%。ISSR分子標記產生的聚類圖將23份紫心甘薯品種分為5大類群，遺傳相似系數(shù)范圍為0.07～0.62，均值為0.32，表明23份貴州紫心甘薯種質資源的親緣關系比較接近，黔紫薯1號和13－4－1的最大，為0.62；13－32－36和13－27－5的最小，為0.07。 第 1 類 為 13－4－1、13－24－2、13－26－3、13－27－6、13－27－1、13－4－2、13－19－3、13－24－2、13－27－5、13－32－36、13－34－15、13－34－22、徐紫1號和徐紫糯共計15份；第2類為13－24－1、13－27－2、濟薯18和13－32－38等4份；第3類為13－35－16和寧紫薯1號等2份；13－32－35和黔紫薯1號分別為第4類和第5類，都只有1份。

ISSR分子標記聚類分析把23份貴州紫心甘薯種質資源分為不同的群別，較好地明晰了23份貴州紫心甘薯種質資源的親緣關系，在今后貴州省紫心甘薯新品種選育工作中，應引進一些遺傳相似系數(shù)較大即親緣關系較遠的紫心甘薯種質資源進行親本組配，可選育出性狀優(yōu)異的雜交后代。

圖4 23份貴州紫心甘薯種質資源的ISSR聚類分析

［1］Yoshimoto M，Yamaka O，Suda I.Physiological function of purple colored flesh sweetpotato［J］.Food Processing，1998，33（8）：15－17.

［2］明興加，李坤培，張明，等.紫色甘薯的開發(fā)前景［J］.重慶中草藥研究，2006（6）：55－60.

［3］孫洪，程靜，詹克慧，等.ISSR標記技術及其在作物遺傳育種中的應用［J］.分子植物育種，2005，3（1）：123－127.

［4］Pradeep R M，Sarla N，Siddiq E A.Inter simple sequence re－peat ISSR polymorphism and its application in plant breeding［J］.Euphytica，2002，128：9－17.

［5］孫洪，程靜，詹克慧，等.ISSR標記技術及其在作物遺傳育種中的應用［J］.分子植物育種，2005，3（1）：123－127.

［6］賀學勤，劉慶昌，王玉萍，等.中國甘薯地方品種的遺傳多樣性分析［J］.中國農業(yè)科學，2005，38（2）：250－257.

［7］李強，揭琴，劉慶昌，等.甘薯基因組DNA高效快速提取方法［J］.分子植物育種，2007，5（5）：743－746.

［8］宋吉軒，雷尊國，黃團，等.甘薯ISSR－PCR反應體系的優(yōu)化［J］.貴州農業(yè)科學，2009，37（11）：25－26，29.

［9］宋吉軒，雷尊國，丁海兵，等.貴州甘薯地方種質資源ISSR遺傳多樣性分析［J］.種子，2011，30（3）：76－80.

［10］李強，劉慶昌，翟紅，等.中國甘薯主要親本遺傳多樣性的ISSR分析［J］.作物學報，2008，34（6）：972－977.

［11］賀學勤，劉慶昌，翟紅，等.用 RAPD.ISSR和 AFLP標記分析系譜關系明確的甘薯品種的親緣關系［J］.作物學報，2005，31（10）：1 300－1 304.