王建義，賀義才，朱松林，馬佳琳，梁書平，馬彥廣

(1.山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012；2.山西省呂梁山國有林管理局上莊油松種子園，山西 隰縣 041300)

油松(Pinustabulaeformis)具有抗寒、耐旱、耐瘠薄等特點，是我國北方重要的鄉(xiāng)土樹種和造林綠化樹種。在油松天然林分中，經(jīng)過長期的自然選擇形成不同的自然類型，個體間差異明顯，具有很大的遺傳改良潛力，國外已經(jīng)對油松11種酶系統(tǒng)作過研究[1]，從酶譜種類、等位基因頻率及雜合率來看，在酶水平上是一個變異豐富的樹種[2～4]。為此，研究和評價油松遺傳多樣性，對于油松育種理論和實踐都具有重要意義[5,6]。上世紀90年代，我國開始利用同工酶分析油松群體的遺傳結(jié)構(gòu)和變化趨勢，直接在基因位點上分析油松天然群體的遺傳變異，評價和探討良種的遺傳多樣性的[7～9]。本文采用形態(tài)結(jié)合同工酶技術(shù)，分析山西省太岳山國有林管理局靈空山林場的5個天然群體的遺傳多樣性、等位基因酶的遺傳變異以及群體變異與地理因素之間的關(guān)系，為山西省油松種質(zhì)資源的開發(fā)利用研究提供科學(xué)依據(jù)[10,11]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

靈空山林場位于山西省太岳山腹地，介于東經(jīng)110°01′46″～112°08′12″，北緯36°33′52″～36°40′之間，海拔1 200～1 961 m之間，土壤為黃土質(zhì)棕壤和山地褐土。靈空山區(qū)屬于暖溫帶大陸性季風氣候，冬季少雪干旱，春季多風干燥，夏季雨量集中，年均氣溫6.2 ℃，年均降雨量662 mm，相對濕度69.8%～74.3%。靈空山區(qū)主要樹種有油松、遼東櫟、白樺、山楊等，其中油松面積約2 493 hm2。試驗材料采自靈空山林場牛槽溝、五龍川、麻刺背、刁王坪、陳家溝等5塊生長良好，林相整齊，無病蟲害的油松林，在每個林分中選擇30株油松樣木，株距約30 m。油松林分情況見表1。

表1 油松林分情況Table 1 Distribution of Pinus tabulaeformis forest

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)特征

針葉采自樹冠上部1/3處，每株取針葉33束，測量其長度值。球果采自樹冠中上部，在東南西北四個方向各采5個球果，每株20個球果，測量球果長、寬和種子百粒重。

1.2.2 同工酶試驗

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。電泳3 h后，待溴酚蘭指示劑移至液面1 cm 時，停止電泳，剝膠染色。

同工酶位點的確定是由不同的位點由連字符后的數(shù)字代表，從離正極最近的位點依次用1，2，3，… 表示。同一位點等位基因根據(jù)譜帶的遷移率，依次用A，B，C…表示。SA表示無活性或活性極弱的譜帶[12,13]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件 Pop Gen 32和 SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計出多態(tài)位點百分率、等位基因平均數(shù)、等位基因頻率、期望雜合度、基因分化系數(shù)、和遺傳距離。

a．多態(tài)位點百分率(P)多態(tài)位點百分率是同工酶測定多態(tài)的位點占總位點數(shù)的百分比。

b．等位基因平均數(shù)(A)

式中:ai為第i個位點的等位基因數(shù)；n為同功酶測定的位點總數(shù)。

c．等位基因頻率(fij)

式中:Nij為基因的個數(shù)；N為基因的總數(shù)。

4)王利溥[16]在研究地形對氣溫和降水的影響時指出:大氣水汽含量隨海拔增加而減少、地形起伏造成的局地環(huán)流能促進上升運動和地形對氣流的動力抬升作用對降水影響顯著;地形對氣溫的影響主要體現(xiàn)在地形對輻射分布和對氣流方向、速度的改變。關(guān)于山地地形風的分布特點,傅抱璞[17]指出,在起伏地形中,由于受局地環(huán)流和地形障礙的影響,即使在非常鄰近的地方,其風向也可以很不相同。因此,為了能夠進一步探討地形對氣溫、降水和風速等要素的影響,更加精細、更多樣的地形特征信息的應(yīng)用顯得愈發(fā)重要,這將在今后的研究中做深入探討。

d．平均期望雜合度(He)

式中：hei為第i個位點期望雜合度；h為同功酶測定的位點總數(shù)。

e．基因分化系數(shù)(GST)

式中：Ht為總?cè)后w的基因多樣度；Hs為群體內(nèi)基因多樣度。

GST反映了群體間變異占總變異的比值大小，是度量群體分化的理想指標。

f．遺傳距離(D)

式中：JX為在X群體隨機選出的基因相同概率的平均數(shù);JY為在Y群體隨機選出的基因相同概率的平均數(shù);JXY為在X，Y兩個群體隨機選出的兩個基因相同概率的平均數(shù);fXij=X群體第i個位點第j個等位基因的頻率；fYij=Y群體第i個位點第j個等位基因的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體間形態(tài)特征值變異分析

油松群體、群體內(nèi)單株及各性狀群體特征值列于表2和表3。不同群體間針葉長變幅為7.5～13.6 cm；球果長變幅4.2～7.6 cm；球果寬變幅2.8～4.8 cm；百粒重變幅3.43～6.4 g。百粒重的變異系數(shù)明顯大于針葉長、球果長和球果寬的變異系數(shù)。因此，我們推測百粒重可能受立地條件影響較大。各性狀方差分析結(jié)果表明，群體間和群體內(nèi)均未達顯著水平[14]。

表2 5個油松林分各性狀特征值
Table2 Characteristic values of characters in 5 pine forests

變量Variable均值Mean最大值Maximum最小值Minimum標準差Standarddeviation變異系數(shù)/%Coefficientofvariation針葉長/cm10 613 67 51 11510 59球果長/cm5 57 64 20 55110 22球果寬/cm3 84 82 80 3258 88百粒重/g4 96 63 50 73315 32

表3 各性狀方差分析表Table 3 Analysis of variance of each character

2.2 同工酶分析

2.2.1 酶譜分析

GOT在油松單株中均有GOT-1和GOT-2兩個染色區(qū)。GOT-1有慢帶和快帶2種酶帶形式，GOT-2有3種酶譜形式。GOT重復(fù)性好，在其位點上存在差異；ADH和SDH在油松單株中均有1個染色區(qū)，均受1個位點控制，有3種譜帶形式。MDH在油松單株中有2個染色區(qū)，受2個位點控制，MDH-1 和MDH-2分別有3種和4種譜帶形式。ME在油松單株中均顯示1條清晰的譜帶，有1個染色區(qū)，受1個位點控制，屬單態(tài)位點。

2.2.2 群體基因變異水平

圖1 GOT酶譜Fig.1 GOT zymogram

圖2 ADH酶譜Fig.2 ADH zymogram

圖3 SDH酶譜Fig.3 SDH zymogram

圖4 MDH酶譜Fig.4 MDH zymogram

由表4可見，所有油松群體中有Got-1、Got-2、Adh-1、Sdh-1、Mdh-1、Mdh-2等6個位點是多態(tài)的。只有Me-1位點是單態(tài)的。各位點在所有油松林分中的He值按大小依次為Sdh-1(0.401)、Adh-1(0.243)、Mdh-1(0.236)、Mdh-2(0.232)、Got-1(0.196)、Got-2(0.125)和Me-1。由于He平均值在位點間變化較大，推測不同位點間有較大的異質(zhì)性[15]。

油松群體中多態(tài)位點百分率相同，平均期望雜合度變化范圍為0.154～0.267，平均為0.210。等位基因平均數(shù)變化范圍為2.02～2.48，平均為2.20(表5)。說明群體內(nèi)等位基因的豐富度一般，群體間變異小，遺傳多態(tài)參數(shù)的均值小，群體在酶位點上變異水平低[16]。

2.2.3 群體間的遺傳分化

過對各個天然群體變異進行基因多樣度分析，得出其同工酶位點上的變異總量，以及在群體間和群體內(nèi)的分布情況，由表6可見，Gst值在位點間變化范圍為0.006 4～0.071 4，變化幅度較大。7個位點的Gst平均值為0.045 7，表明群體間的變異量平均占總?cè)后w的4.57%，95.43%的變異發(fā)生在群體內(nèi)。

2.2.4 群體間遺傳距離

分析各個群體間的Nei’s遺傳距離D(表7)，刁王坪與陳家溝遺傳距離為0.984 7，牛槽溝分別與刁王坪、陳家溝的遺傳距離是0.986 2、0.994 6。表明群體間遺傳距離變動范圍非常接近，群體間分化程度并不大。

2.2.5 同工酶變異與海拔的關(guān)系

結(jié)合各群體的遺傳變異水平和海拔高度可知，刁王坪、陳家溝及牛槽溝海拔高度相近，變化幅度小，群體變異相似。五龍川與麻刺背的群體變異相似。表明油松群體的同工酶變異水平與海拔高度變化有關(guān)，即海拔高度變化大，群體變異就大；海拔高度變化小，群體變異就小。

3 結(jié)論與討論

3.1 油松群體間的分化

從5個油松優(yōu)良林分表現(xiàn)性狀和同功酶分析看出，油松天然群體的遺傳距離與海拔間無明顯的相關(guān)關(guān)系。群體間差異很小，是相對穩(wěn)定的，具有可遺傳穩(wěn)定性。由此也可推斷出靈空山優(yōu)良種源的性狀表現(xiàn)也具有可遺傳穩(wěn)定性[17～19]。從遺傳距離分化看，林分間的變異量平均占總?cè)后w的的4.50%，而大多數(shù)的變異(95.50%)存在于林分內(nèi)的個體。說明個體差異還是非常明顯的。

3.2 油松群體間遺傳距離

對群體的遺傳一致度(I) 和遺傳距離(D) 進行分析發(fā)現(xiàn)，遺傳一致度(I) 較高，刁王坪與陳家溝遺傳距離為0.984 7，牛槽溝分別與刁王坪、陳家溝的遺傳距離是0.986 2、0.994 6，這表明群體間遺傳距離非常接近(圖5)。由此可見，群體間的遺傳距離較近與它們分布區(qū)之間的地理距離較近有一定關(guān)系，油松是高壽命的風媒受粉樹木，較近的地理距離使它們之間的基因交流成為可能，再經(jīng)過多世代的遺傳選擇使群體間的遺傳趨于一致[20～22]。

表4 各群體等位基因頻率及期望雜合度Table 4 allele frequency and expected heterozygosity of each population

表5 各群體的遺傳參數(shù)Table 5 Genetic parameters of each population

表6 遺傳分化參數(shù)值表Table 6 Genetic differentiation parameter values

表7 各群體間的遺傳距離Table 7 Genetic distances among populations

圖5 各群體間遺傳距離系統(tǒng)圖Fig.5 Genetic distance map between populations

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