高崧瀛 孫健 黃巍 姜月紅 李冰 單靜 孫洋 王鋒 湯維波

（1黑龍江省醫(yī)院整形頜面外科 黑龍江 哈爾濱 150000）

（2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢中心 黑龍江 哈爾濱 150000）

（3黑龍江省醫(yī)院 黑龍江 哈爾濱 150000）

微囊化技術(shù)具有免疫隔離作用，它能使微囊內(nèi)的細(xì)胞不受免疫排斥的影響，同時機(jī)體內(nèi)小分子營養(yǎng)物質(zhì)可自由通過微囊，為囊內(nèi)細(xì)胞提供營養(yǎng)。有實(shí)驗(yàn)研究表明微囊化與否細(xì)胞VEGF分泌情況無顯著差異[1]。微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞在一定時期內(nèi)分泌VEGF，對組織的成活或再生有一定作用[2]。微囊化材料的不同，可使微囊的崩解時間不同，我們應(yīng)用于改善皮瓣的微囊只需要3～4周持續(xù)存在，能穩(wěn)定分泌VEGF即可，移植皮膚或皮瓣成活后不再需要持續(xù)的、外源性的VEGF分泌。我們應(yīng)用的海藻酸鹽制備的微囊可持續(xù)2～3個月崩解，但其是否有部分長期存在，是否能較長時期內(nèi)持續(xù)分泌VEGF，從而誘發(fā)機(jī)體腫瘤或其他顯著異常情況的風(fēng)險，尚無文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用裸鼠進(jìn)行此項研究結(jié)果報道如下。

1.材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用BALB裸小鼠，共30只，（雌雄各半,4～6周齡，18～20g），購于長春實(shí)驗(yàn)動物中心。置于無特定病原體（SPF）環(huán)境中飼養(yǎng)，（恒溫25～27℃，恒濕45～50%），飲用水及食物均經(jīng)滅菌。

1.2 方法

1.2.1 （1）將凍存的pcDNA6/HisA-VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞進(jìn)行解凍、復(fù)蘇。加入含有血清DMEM，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。（2）微囊化過程，將1g海藻酸鈉加入到100ml MilliQ水中，渦旋使使部分海藻酸鹽溶解，然后旋轉(zhuǎn)器上過夜。應(yīng)用MilliQ水配制氯化鋇溶液，濃度為30mmol/L。紫外滅菌。將轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞胰酶消化，然后轉(zhuǎn)移入一50ml falcon試管中，500rpm離心5min，然后棄去上清液。以20ml 0.9%NaCl重懸沉淀，500rpm離心5min，然后棄上清。重復(fù)上述步驟。應(yīng)用微囊發(fā)生器進(jìn)行微囊化，調(diào)節(jié)參數(shù)（氧氣流量為8L/min，氧氣壓力100kpa）。以含有DMEM的培養(yǎng)瓶懸浮微囊化轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞，在37℃/5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 隨機(jī)化將實(shí)驗(yàn)動物裸鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組，每組15只。將實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞0.1ml注于其背部皮下，對照組應(yīng)用未進(jìn)行微囊化的等量的細(xì)胞懸液進(jìn)行相同位置注射。

1.2.3 觀察指標(biāo)與方法 3個月后進(jìn)行背部組織HE染色檢測微囊是否存在。外源性VEGF檢測：取1g注射部位軟組織，提取總VEGF蛋白。因該實(shí)驗(yàn)所用的成肌細(xì)胞已轉(zhuǎn)染攜帶6his-tag,故通過鎳柱純化可得到外源性VEGF蛋白，進(jìn)行Western blot特異性目的蛋白檢測（抗體由美國Pierce公司提供，以操作方法按說明書進(jìn)行），PVDF膜洗滌顯色后，固定，晾干。應(yīng)用掃描儀掃描得到結(jié)果。裸鼠重要臟器解剖檢測。

2.結(jié)果

2.1 在40天時，對照組裸鼠意外死亡1只，給予重要臟器

解剖檢查，未見異常發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行其他項目檢測。給予排除此實(shí)驗(yàn)項目。

2.2 微囊觀察

注射區(qū)域標(biāo)記部位切取組織，經(jīng)顯微鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)微囊存在，未見組織異常增生，未見新生的異常血管，未見局部腫瘤樣結(jié)構(gòu)，表面皮膚完好。

2.3 外源性VEGF檢測

未檢測到外源性VEGF蛋白。

2.4 解剖檢查

二氧化碳安樂死方法處死動物，對裸鼠皮膚、肺部、肝臟、胰腺、胃腸等解剖，進(jìn)行大體及顯微鏡下檢查，未發(fā)現(xiàn)任何腫瘤樣結(jié)構(gòu)，未見明顯血管異常增生。

3.結(jié)論

通過微囊化組和實(shí)驗(yàn)對照組觀察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組微囊崩解，實(shí)驗(yàn)組及對照組均未見外源性VEGF分泌，未見裸鼠腫瘤發(fā)生。

4.討論

海藻酸鹽制備的微囊在體內(nèi)的存在時間較短，恰好可被應(yīng)用于輔助植皮或皮瓣成活等應(yīng)用的時間要求。這樣，可減少因?yàn)槲⒛一?xì)胞持續(xù)存在，能夠持續(xù)分泌VEGF，從而增加誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險，但此方法的安全性也需證實(shí)，故設(shè)計此實(shí)驗(yàn)，通過本實(shí)驗(yàn)可初步除外其遠(yuǎn)期誘發(fā)腫瘤或血管增生性疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)將未進(jìn)行微囊化的轉(zhuǎn)VEGF基因成肌細(xì)胞懸液作為對照組，可幫助了解微囊化免疫隔離對VEGF持續(xù)分泌的影響，未進(jìn)行微囊化的VEGF也可能存在一定時期內(nèi)持續(xù)分泌VEGF可能，故也設(shè)計在實(shí)驗(yàn)中，因?qū)嶒?yàn)樣本較少，且其他組如鹽水對照、空微囊等無明顯致瘤風(fēng)險，故未設(shè)置其他組作為實(shí)驗(yàn)對照。目前研究認(rèn)為血管的發(fā)生過程對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起著重要作用，VEGF在血管發(fā)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。有研究表明，VEGF參與腫瘤進(jìn)程并不局限于促進(jìn)血管生成和增加血管通透性。VEGF可以與腫瘤細(xì)胞表面的受體相結(jié)合激活下游信號通路，直接參與腫瘤干細(xì)胞形成、腫瘤發(fā)生以及腫瘤遷移等過程，VEGF還可以通過調(diào)控miRNA參與炎癥反應(yīng)。但多大劑量、作用時間與誘發(fā)腫瘤的相關(guān)性，以及外源性VEGF分泌等對內(nèi)源性VEGF的影響等尚需進(jìn)一步研究。