黃青青 錢燕 王丹

出生缺陷是指胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生解剖學(xué)和/或功能上的異常[1]。出生缺陷發(fā)病機制復(fù)雜，遺傳和/或環(huán)境因素交互影響參與其發(fā)生[2]。近年來國內(nèi)外研究報道都證實了同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）與先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）、神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs）和唇裂等多種出生缺陷的發(fā)生密切相關(guān)[3-5]。鑒于出生缺陷發(fā)生率逐年增加，探尋Hcy誘發(fā)出生缺陷的分子機制至關(guān)重要。因此，本文就Hcy導(dǎo)致出生缺陷的分子機制作一綜述。

1 H cy與血流動力學(xué)改變

胎盤及胚胎內(nèi)臟器穩(wěn)定的血流動力學(xué)是維持胚胎生存及發(fā)育的基礎(chǔ)。研究顯示，發(fā)育早期的雞胚注射低濃度Hcy后，在胚齡3.5d（相當(dāng)于人胚胎5～8周）時，雞胚左、右心室射血分?jǐn)?shù)，峰流速及流出道收縮時間均顯著下降，而流出道舒張時間延長；同時，Hcy組雞胚心率明顯低于對照組。而此時B超卻未發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)異常，提示Hcy能夠直接誘發(fā)胚胎重要臟器血流動力學(xué)紊亂，而且這種改變早于形態(tài)學(xué)畸形的發(fā)生[6]。另有研究通過靜脈夾閉實驗驗證了上述結(jié)果，即通過夾閉發(fā)育早期（胚齡4d）雞胚的對橫向卵黃靜脈5h，心臟內(nèi)血流動力學(xué)參數(shù)發(fā)生急劇下降，雞胚心臟后期出現(xiàn)明顯的流出道畸形，特別是室間隔缺損、瓣膜異常和咽部主動脈畸形，且畸形與Hcy處理導(dǎo)致的畸形類似[7]。以上證據(jù)提示，Hcy能通過引起血流動力學(xué)紊亂，從而誘發(fā)多種類型的CHD。

有研究報道，給予雞胚50、75和100mM的Hcy處理72h后發(fā)現(xiàn)，胎盤血管密度分別減少50.3%、70.6%和74.0%，同時，雞胚存活率下降32%、50%和66%[8]。說明Hcy可能通過抑制血管生成削弱胚胎存活力。隨著Hcy病理機制的深入研究，Latacha等[8]發(fā)現(xiàn)Hcy可以從基因和蛋白水平抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)。VEGF是關(guān)鍵的血管生成調(diào)控因子，其表達(dá)的下降會導(dǎo)致胎盤/胚胎血管生成受抑，組織血流重新分布，間接加劇了胚胎血流動力學(xué)的紊亂。另外，Hcy作用后，心臟局部組織中內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）表達(dá)下降，內(nèi)皮型一氧化氮合酶-3（endothelial nitric oxide synthase-3，eNOS-3）表達(dá)增加，這兩者作用相互制衡[9]。ET-1作為另一種血管生長因子，負(fù)責(zé)血管收縮的調(diào)控；eNOS-3介導(dǎo)一氧化氮的合成，并負(fù)責(zé)血管舒張。在血流正常的心臟中，eNOS-3通常表達(dá)于高剪應(yīng)力的組織中，如房室管和流出道；而ET-1往往在低剪應(yīng)力的組織中呈高表達(dá)。隨著胎盤/胚胎血管分布及其血流動力學(xué)的改變，胚胎臟器內(nèi)部血流供應(yīng)減少，血管剪應(yīng)力也隨之降低[7]，繼而導(dǎo)致ET-1和eNOS-3表達(dá)及分布異常，最終引起臟器發(fā)育不平衡[6，9]。

以上證據(jù)提示Hcy可通過改變胎盤及發(fā)育早期胚胎臟器的血流動力學(xué)參數(shù)，引起臟器時空發(fā)育紊亂，從而導(dǎo)致臟器的形態(tài)學(xué)畸形。

2 H cy與D N A損傷

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體內(nèi)Hcy水平過高時，機體需要更多的葉酸來代謝過多的Hcy[10]；增加葉酸攝入可改善高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy），兩者水平呈負(fù)相關(guān)；提示HHcy會導(dǎo)致葉酸相對不足。有報道認(rèn)為，體內(nèi)葉酸不足時，胸腺嘧啶合成障礙，尿嘧啶（dUMP）被錯誤地?fù)饺隓NA鏈中，機體將啟動以下兩種反應(yīng)：（1）如果在互補DNA雙鏈上同時摻入dUMP，后者會被損傷修復(fù)系統(tǒng)識別并切除，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，進而誘發(fā)染色體離斷；（2）若dUMP未被切除，則會在DNA復(fù)制過程中會產(chǎn)生G-C替換，引起點突變。表明HHcy可以通過引起葉酸“相對不足”，誘發(fā)DNA損傷。

Hcy還能直接誘發(fā)DNA損傷。Ye等[11]體外分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)元并予以0.25mM Hcy處理4h，堿性彗星試驗（檢測DNA鏈斷裂）檢測發(fā)現(xiàn)70%的神經(jīng)元細(xì)胞核呈現(xiàn)損傷的陽性拖尾，而對照組陽性細(xì)胞核只占8%，提示Hcy可造成細(xì)胞DNA鏈斷裂。研究發(fā)現(xiàn)亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）發(fā)生C667T或A1298C突變者，血漿Hcy水平升高。MTFHR C667T TT基因型者和C667T CT或C667T CC基因型者相比，血漿Hcy水平升高更為明顯；同時，C667T TT基因型者細(xì)胞DNA損傷程度也較C667T CC或C667T CT基因型者更為嚴(yán)重。提示Hcy能夠直接誘發(fā)DNA損傷，且呈濃度依賴性。不僅如此，F(xiàn)enech[12]收集不同年齡健康人的淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，血漿Hcy濃度與染色體微核（染色體異常表現(xiàn)之一）形成呈正相關(guān)；而通過葉酸降低Hcy水平，能夠緩解染色體微核的形成。另有研究顯示，HHcy可導(dǎo)致人類21號染色體發(fā)生異常，從而增加Down’s綜合征的發(fā)生風(fēng)險。說明Hcy不僅損傷DNA，還可造成染色體異常，影響人類基因組的穩(wěn)定性[12]。

以上研究提示飲食和/或遺傳因素造成的高水平Hcy都可以誘發(fā)DNA損傷，甚至染色體異常。

3 H cy與D N A甲基化

Song等[13]檢測21-三體綜合征患兒血Hcy和單核細(xì)胞甲基化水平，并與年齡相匹配的正常兒童相比后發(fā)現(xiàn)，21-三體綜合征患兒血漿Hcy水平升高，細(xì)胞DNA甲基化程度下降[14]。這一證據(jù)提示，高水平Hcy引發(fā)的低DNA甲基化參與21-三體綜合征的發(fā)生。

國外學(xué)者收集因CHD和/或21-三體綜合征終止妊娠的患兒心臟和正常人的血液標(biāo)本，觀察了分布于407個基因上的465個CpG島的甲基化程度，發(fā)現(xiàn)CHD和21-三體綜合征胎兒的心肌基因組甲基化程度均顯著低于正常對照組[15]。同時，Chowdhury等[16]的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，與生育正常子代的母親相比，母親生育無癥狀CHD者，其基因組中大部分CpG島的甲基化程度下降；同時，作者還鑒定出絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路相關(guān)基因MAP4K5和MAPK13為甲基化差異基因。MAPK通路通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[17-18]。以上證據(jù)提示，MAPK通路相關(guān)基因的異常甲基化參與了CHD的發(fā)生。此外，小鼠透明質(zhì)酸合酶2（hyaluronan synthase 2,Has2）基因是心內(nèi)膜發(fā)育和瓣膜形成的必需基因。在正常胎鼠妊娠14.5d時（瓣膜發(fā)育期），Has2基因表達(dá)下調(diào)并伴有甲基化增加。如果Has2基因持續(xù)高甲基化狀態(tài)，將引起流出道細(xì)胞過度增殖，從而導(dǎo)致心臟流出道狹窄[19]。因此，DNA甲基化還通過調(diào)控靶基因的時空表達(dá)參與心臟的正常發(fā)育。

異常DNA甲基化還參與NTDs的發(fā)生。在小鼠NTDs模型中，全基因組DNA甲基化于胚胎妊娠3.5d開始增加，妊娠6.5d達(dá)高峰，整個孕期均維持高甲基化狀態(tài)。NTDs小鼠Siah1b和Prkx基因的甲基化程度減少，隨之伴有上述基因表達(dá)的增加。據(jù)報道，Siah1b可被p53活化，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或凋亡[20]；Prkx基因編碼絲氨酸酪氨酸激酶，調(diào)控神經(jīng)元增殖、分化和遷移[21]。葉酸是公認(rèn)的甲基供體前體，經(jīng)葉酸治療后小鼠Siah1b和Prkx基因甲基化增多且表達(dá)減少，NTDs發(fā)生率也明顯下降[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，Hcy是全基因組DNA甲基化程度的重要調(diào)控因子[23-24]。Dominquez-Salas等[25]發(fā)現(xiàn)，母親孕期血漿Hcy水平增高，子代來自于中胚層的單核細(xì)胞和來自于外胚層的毛發(fā)的DNA甲基化均減少；也就是說，母親血漿Hcy水平和子代DNA甲基化程度呈反比。因此，胚胎在基因印跡過程中暴露于高水平Hcy環(huán)境，甲基供體不足和DNA甲基化異常，最終誘發(fā)多種出生缺陷。

4 H cy與細(xì)胞凋亡

胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡失常會干擾組織、器官形態(tài)建立和功能發(fā)揮，從而導(dǎo)致畸形發(fā)生。1996年，Rosenquist等[26]首次發(fā)現(xiàn) Hcy能誘發(fā) NTDs，Hcy濃度為 0.5～2.5、5～7.5、10 和 15μM 時，NTDs發(fā)生率分別為0%～5%、≤18%、≥30%和≥75%；不僅如此，NTDs發(fā)生部位還檢測到明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[27]。另外，研究表明，Hcy也可誘導(dǎo)雞胚心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞凋亡，繼而導(dǎo)致心臟流出道心肌化減少、流出道墊體積增大和室間隔缺損[28]。以上證據(jù)提示，Hcy能夠通過細(xì)胞凋亡誘發(fā)多種出生缺陷。

Hcy致細(xì)胞凋亡的機制如下：（1）氧化損傷：Hcy側(cè)鏈上的巰基發(fā)生自氧化反應(yīng)的過程中，產(chǎn)生大量的H2O2、OH-和超氧陰離子（）等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。ROS啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的完整性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、甚至死亡。在大鼠實驗中，當(dāng)腦組織和海馬神經(jīng)祖細(xì)胞暴露于高濃度Hcy環(huán)境時，MAPK信號通路被活化，活化的MAPK通路抑制下游凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤-2基因表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，最終表現(xiàn)為宮內(nèi)生長遲滯和腦容量減少[29]。（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）：由于各種原因引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積錯誤折疊/未折疊蛋白或Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，即為ERS。劇烈或長程的ERS會激活凋亡程序以除去嚴(yán)重受損的細(xì)胞。Zhang等[30]研究認(rèn)為，Hcy誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞死亡，是通過未折疊蛋白聚集引起ERS，而非氧化損傷。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，蛋白折疊和分泌受影響，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白積聚引起ERS，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Hcy致出生缺陷機制復(fù)雜，可能是多種機制共同作用的結(jié)果，仍有待前瞻性流行病學(xué)調(diào)查和進一步的體內(nèi)外研究。但目前大量研究均表明Hcy與出生缺陷密切相關(guān)，這提示監(jiān)測孕母Hcy水平并予以干預(yù)，可早期預(yù)防出生缺陷的發(fā)生。