王文聞， 萬(wàn)佳藝， 肖燕， 吳靚驊， 繆建華

胰腺癌惡性程度高，在歐美等國(guó)家位列第4位腫瘤相關(guān)死因[1]。在全球范圍內(nèi)，每年約有227 000人新診斷為胰腺癌，同時(shí)幾乎相同數(shù)量的患者死于胰腺癌[2]。盡管科研工作者及臨床醫(yī)生已在腫瘤預(yù)防、診斷、治療上付諸了大量努力，但仍收效甚微，5年生存率僅為4%[3]。隨著對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)的日益深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了一類特殊的細(xì)胞，在大量的腫瘤細(xì)胞中，這些極微量的細(xì)胞具有自我更新、無(wú)限增殖、多系分化、致瘤性的特征，這些細(xì)胞被命名為腫瘤干細(xì)胞(CSC)[4-5]。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，它們甚至能逃避抗腫瘤藥物的作用產(chǎn)生耐藥導(dǎo)致復(fù)發(fā)[6-7]。乙醛脫氫酶(ALDH)家族由一系列NAD(P)+依賴的氧化酶組成，廣泛分布于各物種中，主要參與細(xì)胞內(nèi)醛類物質(zhì)的氧化代謝過(guò)程，ALDH家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系被逐漸發(fā)現(xiàn)[8]。相比正常組織，ALDH在乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)；高ALDH活性被認(rèn)為是肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等實(shí)體瘤[9-12]腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志。本文以胰腺癌為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)胰腺癌組織中ALDH1a1的表達(dá)，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2012年1月至2016年12月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市第二人民醫(yī)院確診胰腺癌并行胰腺癌根治術(shù)的31例患者病理存檔術(shù)后組織蠟塊；患者術(shù)前均未接受化療和放療等抗腫瘤治療，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。31例患者中男20例，女11例；年齡47～81歲；腫瘤組織分化程度：高分化(Ⅰ級(jí))1例，中分化(Ⅱ級(jí))26例，低分化(Ⅲ級(jí))4例。

1.2 免疫組化 31例組織蠟塊經(jīng)病理科醫(yī)師復(fù)查HE染色確認(rèn)為胰腺癌及切緣切片，標(biāo)本均連續(xù)切成層厚4 μm切片?；瘜W(xué)染色法測(cè)定ALDH1a1、P53、Ki67、胎盤(pán)型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTπ)、肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)的表達(dá)水平。

將組織切片在90 ℃恒溫箱中烘烤1 h，隨后進(jìn)行脫蠟和水化，浸入檸檬酸緩沖液加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，沖洗后每張切片分別滴加一抗50 μl ALDH1a1(美國(guó)Proteintech公司)，P53、Ki67、GSTπ、LRP(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，根據(jù)抗體使用說(shuō)明書(shū)稀釋一抗原液，冰箱4 ℃過(guò)夜。第2天切片復(fù)溫沖洗，每張切片滴加50 μl二抗，二抗為MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit 即用型試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，孵育沖洗后DAB顯色5 min，然后沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。陰性對(duì)照采用PBS液體替代一抗，其余步驟同前。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 高倍視野(×400)光鏡下計(jì)數(shù)，每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，以平均每100個(gè)細(xì)胞中含著色細(xì)胞個(gè)數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞率，取均值。蛋白表達(dá)水平評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞無(wú)著色或著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)0分；著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)5%～25%計(jì)1分；著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)26%～50%計(jì)2分；著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)51%～75%計(jì)3分；著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)76%～100%計(jì)4分。陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。兩者相乘：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽(yáng)性(+)；5～8分為中等陽(yáng)性(++)；9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。用試劑公司提供的陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D在同一條件下染色作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液替代一抗作為陰性對(duì)照。

逐一核實(shí)每例患者資料，由兩名病理醫(yī)師雙盲觀察切片，判讀免疫組化染色結(jié)果，結(jié)果有差異時(shí)由兩人共同判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)比較ALDH1a1在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平；t檢驗(yàn)比較ALDH1a1各表達(dá)水平組之間的差異；配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較各蛋白表達(dá)水平。生存分析采用Kaplan-Meier法。所有數(shù)據(jù)間差異以P值表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1a1蛋白在胰腺癌組織和胰腺癌癌旁正常組織中的表達(dá) ALDH1a1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。31例胰腺癌組織中，8例(25.8%)為ALDH1a1弱陽(yáng)性，7例(22.6%)為ALDH1a1中等陽(yáng)性，16例(51.6%)為ALDH1a1強(qiáng)陽(yáng)性。在癌旁正常胰腺組織中，26例(83.9%)為ALDH1a1弱陽(yáng)性，4例(12.9%)為ALDH1a1中等陽(yáng)性，僅1例(3.2%)為ALDH1a1強(qiáng)陽(yáng)性。經(jīng)配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)比較，ALDH1a1在胰腺癌組織中表達(dá)水平高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 ALDH1a1蛋白在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) [例(%)]

圖1 免疫組化法檢測(cè)ALDH1a1在胰腺癌組織中的表達(dá)(SP染色 ×100)1A：ALDH1a1在胰腺癌細(xì)胞質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)；1B：ALDH1a1在胰腺癌細(xì)胞質(zhì)中呈中等陽(yáng)性表達(dá)；1C：ALDH1a1在胰腺癌細(xì)胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

2.2 ALDH1a1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者術(shù)后無(wú)病生存期之間的關(guān)系 在31例患者中，4例出院后失訪，余27例隨訪至CT檢查提示腫瘤復(fù)發(fā)。結(jié)果顯示：ALDH1a1弱陽(yáng)性組中位無(wú)病生存期為510 d，平均無(wú)病生存期為302 d；ALDH1a1中等陽(yáng)性組中位無(wú)病生存期為388 d，平均無(wú)病生存期為424 d，兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.438)。ALDH1a1強(qiáng)陽(yáng)性組中位無(wú)病生存期為84 d，平均無(wú)病生存期為131 d，短于ALDH1a1弱陽(yáng)性組(P=0.013)和ALDH1a1中等陽(yáng)性組(P=0.007)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

圖2 ALDH1a1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者無(wú)病生存率的關(guān)系

2.3 ALDH1a1蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 ALDH1a1弱陽(yáng)性組與中等陽(yáng)性組的無(wú)病生存期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此將ALDH1a1弱陽(yáng)性組與中等陽(yáng)性組合并為1組與ALDH1a1強(qiáng)陽(yáng)性組進(jìn)行比較。見(jiàn)表2。

經(jīng)配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較各蛋白表達(dá)水平，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較ALDH1a1各表達(dá)水平組之間的差異。結(jié)果顯示，ALDH1a1表達(dá)水平與胰腺癌患者的性別、年齡、腫塊部位無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)，而與腫瘤組織分化程度、腫塊大小相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 ALDH1a1與P53、Ki67、GSTπ、LRP蛋白表達(dá)水平的關(guān)系 突變型P53蛋白及Ki67蛋白均為細(xì)胞核著色；GSTπ蛋白為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核著色；LRP蛋白為細(xì)胞質(zhì)著色。將ALDH1a1弱陽(yáng)性組與ALDH1a1中等陽(yáng)性組合并為1組，與ALDH1a1強(qiáng)陽(yáng)性組進(jìn)行比較。經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)，ALDH1a1蛋白表達(dá)水平與突變型P53蛋白表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與Ki67、GSTπ、LRP蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 ALDH1a1蛋白表達(dá)與P53、Ki67、GSTπ、LRP蛋白表達(dá)水平的關(guān)系(例)

表2 ALDH1a1蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系(例)

3 討論

胰腺癌患者生存期短，尤其是轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者，我們以未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、接受根治術(shù)的早期胰腺癌患者為研究對(duì)象，旨在闡明胰腺癌惡性行為的可能機(jī)制。

類似于其他實(shí)體瘤[9，11-12]，胰腺癌組織和癌旁正常胰腺組織比較發(fā)現(xiàn)，ALDH1a1蛋白表達(dá)在腫瘤組織中明顯增高，且在相對(duì)惡性程度高的腫瘤中(低分化、腫塊直徑大)表達(dá)尤其顯著，提示ALDH1a1高表達(dá)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，在臨床上可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物。隨訪發(fā)現(xiàn)，ALDH1a1強(qiáng)陽(yáng)性的胰腺癌患者無(wú)病生存期極短，即使接受了根治術(shù)，仍存在短期復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)，證實(shí)ALDH1a1高表達(dá)可作為胰腺癌差預(yù)后預(yù)測(cè)因子。另一方面，ALDH1a1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的患者可能在術(shù)后更需要后續(xù)的高強(qiáng)度抗腫瘤治療。

為探討ALDH1a1促腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，我們觀察了ALDH1a1與凋亡增殖耐藥相關(guān)蛋白的關(guān)系。野生型P53作為一種抑癌基因，其突變型與腫瘤惡性程度相關(guān)，也提示細(xì)胞凋亡調(diào)控的異常[13]；Ki67作為細(xì)胞周期標(biāo)志物，其高表達(dá)可用于判斷細(xì)胞的快速增殖活性[14]。多藥耐藥與腫瘤進(jìn)展尤其治療后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，因此我們也關(guān)注了耐藥相關(guān)基因GSTπ和LRP；GSTπ通過(guò)降解藥物，LRP通過(guò)阻止藥物向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減弱化療藥物殺傷作用，介導(dǎo)耐藥[15]。ALDH1a1與Ki67、GSTπ、LRP的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示ALDH1a1可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖和耐藥促進(jìn)腫瘤發(fā)展。有實(shí)驗(yàn)[6，16]也發(fā)現(xiàn)，與ALDH-細(xì)胞相比較，ALDH+細(xì)胞具有明顯的強(qiáng)致瘤性并具有腫瘤侵襲性，且ALDH+細(xì)胞與包括吉西他濱在內(nèi)的化療藥物耐藥密切相關(guān)。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。腫瘤干細(xì)胞可逃避抗腫瘤藥物誘導(dǎo)遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)，ALDH也被認(rèn)為是胰腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志之一[16-17]。我們的研究結(jié)果從一定程度上間接反映了這點(diǎn)。

綜上所述，ALDH1a1與腫瘤惡性行為相關(guān)，可作為胰腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)因子；靶向ALDH1a1可作為潛在的治療胰腺癌方向。樣本量少是本研究的缺陷，今后需進(jìn)行大樣本多中心研究，進(jìn)一步從機(jī)制方面探討ALDH1a1在腫瘤形成進(jìn)展過(guò)程中的作用。

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