張連明 張東友 曾英 李建平

摘 要 利用DNA改善印跡孔穴對模板分子空間識別性能，建立了高選擇性印跡材料的制備新方法，并用于痕量西馬特羅的測定。在金電極表面自組裝固定雙鏈DNA，待西馬特羅與DNA雙鏈進行結(jié)合后，以西馬特羅-DNA復合物為模板，電聚合制備西馬特羅-DNA復合物的分子印跡聚合物膜。去除待測分子西馬特羅，得到對西馬特羅具有高特異性識別能力的分子印跡傳感器。對傳感器制備及工作條件進行了優(yōu)化，利用紫外吸收光譜對西馬特羅與DNA的結(jié)合方式進行了研究。結(jié)果表明，二者之間的相互作用模式為溝槽式結(jié)合。印跡膜以乙醇-乙酸（8∶1，V/V）為洗脫劑，洗脫時間為35 min，重吸附時間為45 min。以鐵氰化物作為探針，其氧化電流與西馬特羅濃度在1.0 × 1013～1.0 × 1010 mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為3.2×1014 mol/L（S/N=3）。將傳感器成功應用于豬肉樣品中西馬特羅的檢測，結(jié)果良好。

關(guān)鍵詞 分子印跡； 西馬特羅； 電化學傳感器； DNA； 選擇性識別

1 引 言

西馬特羅（Cimaterol，CIM）是繼萊克多巴胺、沙丁胺醇和克倫特羅之后的新型“瘦肉精”[1]。因西馬特羅可以減少胴體脂肪含量，促進家畜生長，改變?nèi)赓|(zhì)，經(jīng)常被非法加入到肉畜飼料中[2]。長期大量使用西馬特羅會使其在動物組織內(nèi)積累殘留，造成食用者中毒，產(chǎn)生目眩、惡心、嘔吐、心率加快等癥狀，嚴重者可導致死亡[3]。我國農(nóng)業(yè)部公告第193號文件明確規(guī)定西馬特羅禁止在畜禽生產(chǎn)中使用[4]?，F(xiàn)有的檢測動物組織中西馬特羅的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[5，6]、高效液相色譜法[7，8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9，10]、酶免疫分析法[11，12]和毛細管電泳法[13，14]等。但是，這些方法均存在一定的缺陷，如樣品前處理繁瑣、檢測耗時過長、樣品中組份對分析干擾較大等[15]。因此，發(fā)展操作簡便、靈敏度高、選擇性好、無需復雜前處理過程的西馬特羅殘留檢測方法具有重要意義。

分子印跡聚合物（MIPs）是一類對目標分子具有專一性識別能力并具有記憶功能的聚合物[16～18]。雖然各種瘦肉精分子印跡聚合物已見報道[15，19]，但是，這些分子印跡聚合物由于印跡孔穴識別單元種類和數(shù)量不多， 尚不能對結(jié)構(gòu)相近、官能團相似的瘦肉精分子作有效地分辨[20]。因此，提高印跡聚合物材料的專一性識別能力，發(fā)展高特異性西馬特羅識別方法很有必要。

DNA由于其特殊鏈狀結(jié)構(gòu)及含有豐富的活性基團已被廣泛應用于分子識別領(lǐng)域。Nicholas等[21]利用單鏈DNA（ssDNA）與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用，制備了蛋白質(zhì)分子印跡聚合物。Li等[22]以林可霉素分子為靶物質(zhì)，在堿基庫中篩選出對其具有高親和性的適配體，以適配體-林可霉素復合物為模板分子電聚合于石墨烯表面，發(fā)展了一種適配體-分子印跡傳感器制備方法，該方法借助ssDNA的基團增加印跡膜的識別位點可以增強MIPs的識別能力，然而，印跡孔穴內(nèi)模板分子空間排列的立體選擇性并沒有得到有效改善。研究表明，不同堿基互補可以形成不同的雙鏈DNA（dsDNA）溝槽結(jié)構(gòu)，生物分子可以嵌入dsDNA的溝槽[23，24]，這種結(jié)合方式對生物分子在印跡孔穴中的空間排列可提供構(gòu)象選擇性。

本研究將dsDNA與有機分子溝槽結(jié)合產(chǎn)生的構(gòu)象選擇性引入分子印跡聚合物材料的制備，以進一步提高印跡聚合物的專一性識別能力。以西馬特羅為目標分子，通過AuS鍵將dsDNA固定在金電極表面，待 dsDNA與西馬特羅分子結(jié)合后，以復合物為模板，電聚合形成分子印跡聚合物。去除西馬特羅后，得到與西馬特羅在作用位點、結(jié)構(gòu)及3D構(gòu)象相匹配互補的印跡孔穴，據(jù)此對西馬特羅進行高選擇性識別； 采用鐵氰化物作為探針，實現(xiàn)西馬特羅的定量測定。識別機理如圖1所示。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PGSTAT 128N Autolab電化學工作站（瑞士萬通有限公司），采用三電極系統(tǒng)：工作電極為DNA/MIPs修飾金電極（Φ=3 mm），Ag/AgCl（飽和KCl）電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極； UV-2400PC紫外-可見分光光度計（日本島津公司）； S4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立有限公司）。

西馬特羅（CIM）、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、班布特羅、馬布特羅、西布特羅、溴布特羅標準品（德國Witega Laboratorien公司）； DNA序列（ssDNA序列為：AGAGAG-C6-3′-SH，互補DNA序列為：SH-5′-C6-CTCTCT）由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成，使用時用TE緩沖液（10.0 mmol/L Tris-HCl，100.0 mmol/L NaCl，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制和稀釋； 0.1 mol/L HCl，乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）、 乙酸乙酯、 10% Na2CO3溶液、 Tris-HCl緩沖溶液（0.24 mol/L HCl，0.002 mol/L Tris，pH 7.47）、 0.05 mol/L 三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）、 鄰苯二胺（o-PD，Aladdin公司）。探針分子溶液是含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]溶液，若無特殊說明，所用試劑均為分析純。實驗用水均為二次去離子水。

2.2 DNA/MIPs、DNA/nMIPs及常規(guī)印跡傳感器的制備

將金電極用氧化鋁粉在麂皮上打磨至鏡面。將ssDNA與其互補鏈分別取出解凍10 min并離心， 用TE緩沖液溶解，并用TCEP溶液進行活化1 h后得到1.0×105 mol/L ssDNA及互補鏈（TCEP活化的目的是將巰基修飾的ssDNA之間自然形成的雙硫鍵斷開，便于AuS鍵結(jié)合）。將金電極浸入ssDNA溶液2 h，使ssDNA通過AuS鍵結(jié)合于金電極表面，將上述修飾電極浸入互補DNA鏈溶液2 h， 得到雜交后的dsDNA修飾金電極。將修飾dsDNA的金電極置于4.6×105 mol/L西馬特羅溶液中孵育3.5 h， 使西馬特羅與dsDNA結(jié)合。以1.0×104 mol/L 鄰苯二胺為功能單體，電聚合制備得到印跡聚合物膜（循環(huán)伏安掃描電位范圍：0～0.8 V，掃描速率為0.05 V/s，掃描圈數(shù)為25）。以乙醇-乙酸（8∶1， V/V）為洗脫液，將上述修飾電極置于洗脫液中輕微攪拌35 min， 除去西馬特羅，得到對西馬特羅具有特異性識別能力的DNA/MIPs傳感器。利用相同方法制備了非分子印跡修飾電極（DNA/nMIPs傳感器，制備過程中不添加西馬特羅）及常規(guī)分子印跡傳感器（MIPs傳感器，制備過程中不添加DNA）。

2.3 實驗方法

將傳感器置于不同濃度的西馬特羅溶液中重吸附45 min后檢測。在含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]的探針溶液中，考察傳感器的電化學性能。差分脈沖伏安法（DPV）參數(shù)為：初始電位0.2 V，終止電位+0.6 V，振幅0.05 V，掃速50 mV/s。交流阻抗法（EIS）頻率范圍為100 mHz～100 kHz，振幅為5 mV。

2.4 樣品處理

豬肉樣品購于本地超市， 按農(nóng)業(yè)部標準方法（NY/T 486-2006）處理[25]。取5 mL乙酸乙酯和0.6 mL 10% Na2CO3加入1.0 g磨碎的樣品攪拌均勻，經(jīng)3500 r/min離心，收集有機層，重復操作并收集提取液，待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 自組裝時間及雜交時間的選擇

考察了ssDNA自組裝時間（圖2，曲線a）及互補DNA雜交時間（圖2，曲線b）對電極電化學響應信號強度的影響。當ssDNA濃度為1.0×105 mol/L時，響應信號隨自組裝時間延長而明顯降低，

當自組裝時間超過120 min后，響應信號強度趨于穩(wěn)定，表明自組裝過程達到飽和。將上述修飾電極置于1.0×105 mol/L互補鏈溶液中進行孵育雜交，隨著雜交時間延長，響應信號強度逐漸下降，于120 min后趨于穩(wěn)定。因此選擇自組裝時間及雜交時間均為120 min。

3.2 dsDNA與西馬特羅相互作用研究

利用紫外-可見吸收光譜法研究了西馬特羅與dsDNA之間的相互作用。作用時間對CIM-dsDNA復合物形成的影響如圖3A所示，修飾電極響應信號強度隨著孵育時間的延長而顯著降低，表明隨著孵育時間延長，越來越多的西馬特羅與dsDNA結(jié)合，當孵育時間達到210 min后， 西馬特羅的結(jié)合量達到飽和，響應信號強度趨于穩(wěn)定。因此，后續(xù)實驗選擇西馬特羅與dsDNA的作用時間為210 min。 以Tris-HCl為緩沖液，分別研究了1.2 × 107mol/L西馬特羅溶液、1.2 × 107 mol/L dsDNA溶液及1.2 × 107 mol/L 西馬特羅-dsDNA復合物溶液的吸收光譜（圖3B）。結(jié)果表明，西馬特羅在320 nm處有明顯的紫外吸收，而dsDNA在290 nm處有最大吸收，西馬特羅與dsDNA相互結(jié)合后，西馬特羅-dsDNA （CIM-dsDNA） 復合物最大吸收波長位于320 nm，同時其最大吸收峰強度明顯增強，表明dsDNA與西馬特羅通過弱作用力相互結(jié)合，無新官能團產(chǎn)生。上述結(jié)論與文獻[26]相同。

3.3 聚合條件的選擇

以洗脫效果、印跡膜穩(wěn)定性及識別效果為考察標準，利用DPV研究了聚合物底液中模板分子西馬特羅與功能單體（鄰苯二胺）的配比、掃描速率和電聚合掃描圈數(shù)的影響。掃速及掃描圈數(shù)直接影響印跡膜的厚度及致密度，進而影響洗脫效果及識別效果。實驗結(jié)果表明，在1.0 × 105 mol/L ssDNA、1.0 × 105 mol/L互補鏈及4.6 × 105mol/L西馬特羅條件下，使用1.0 × 104 mol/L o-PD作為功能單體、掃描速率為0.05 mV/s、電聚合掃描圈數(shù)為25圈時，傳感器對目標分子響應效果最佳。

3.4 DNA/MIPs及DNA/nMIPs傳感器對西馬特羅的響應

為驗證DNA/MIPs傳感器對西馬特羅的識別響應，對傳感器制備過程中的電化學性能進行了研究。如圖4A所示，裸金電極（曲線a）具有良好的導電性，而dsDNA（曲線b）及西馬特羅-dsDNA復合物（曲線c）在電極表面組裝后，修飾電極響應信號強度隨修飾物的增加而減弱。繼續(xù)聚合一層致密的聚o-PD層后，由于聚合物層的存在， 嚴重阻礙了電子的傳遞，響應信號強度急劇下降（曲線d）。洗脫西馬特羅后，印跡孔穴可以作為電子傳遞的通道，響應信號增強（曲線e）； 當重吸附不同濃度西馬特羅后，西馬特羅重新占據(jù)印跡孔穴通道而阻礙電子傳遞，響應信號強度隨西馬特羅濃度增加而降低（曲線f和曲線g）。上述結(jié)果表明，本方法制備的印跡材料能夠識別西馬特羅。

為了進一步證明上述結(jié)論，利用交流阻抗法對上述過程進行了研究（圖4B），當dsDNA-西馬特羅復合物修飾在裸金電極表面后（曲線b），其阻抗值較裸電極（曲線a）明顯增加，聚合后，由于存在致密的、導電性差的聚合物膜，阻礙了電子的傳遞過程， 因此敏感膜阻抗值較CIM-dsDNA修飾電極明顯增大（曲線c）； 洗脫目標分子后，由于印跡孔穴可以作為電子傳遞的通道，因此阻抗值降低（曲線d），而重吸附西馬特羅后，印跡孔穴通道被堵塞，敏感膜阻抗值增加（曲線e）。綜上，本方法制備得到的印跡聚合物材料對西馬特羅有識別能力，所得結(jié)論與DPV響應結(jié)論一致。

為了排除物理吸附的干擾，研究了非分子印跡膜DNA/nMIPs傳感器對目標分子西馬特羅的識別能力。如圖4C所示，將dsDNA修飾在電極表面后，探針分子響應明顯（曲線a）。電聚合后，由于致密的聚合物膜存在，修飾電極響應信號強度急劇降低（曲線b），而洗脫后，修飾電極響應信號強度無較大變化（曲線c），重吸附西馬特羅后，修飾電極響應信號強度仍無明顯變化（曲線d），這是因為聚合過程中未加入西馬特羅，因此洗脫后無任何印跡孔穴產(chǎn)生，即不會產(chǎn)生探針分子到達電極表面的通道，因而響應信號基本無變化。重吸附后，西馬特羅不能穩(wěn)定存在于敏感膜表面，因此響應信號無明顯變化。上述研究表明DNA/nMIPs修飾電極對西馬特羅無任何響應。

3.5 分子印跡聚合物膜形貌表征

利用掃描電鏡（SEM）對金電極表面電聚合制備的dsDNA/MIPs敏感膜進行了形貌分析，如圖5所示，電極表面的分子印跡膜覆蓋較為完整，分布較為致密。

3.6 實驗條件優(yōu)化

綜合考慮洗脫效果、印跡材料穩(wěn)定性、 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的影響等因素，分別以乙醇、甲醇、二甲亞砜、乙酸、HNO3-H2O混合液（1∶1，V/V）、乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）、甲醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）作為洗脫劑， 考察洗脫效果。實驗結(jié)果表明，以乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）作為洗脫液，洗脫時間較短，對印跡膜的穩(wěn)定性影響最小。同時，隨著洗脫時間延長，傳感器響應信號強度逐漸增大，表明越來越多的目標分子被洗脫，當洗脫時間超過35 min后，傳感器響應信號強度不再變化，并趨于穩(wěn)定，因此選擇最佳洗脫時間為35 min。

傳感器對西馬特羅的識別過程中，不僅要滿足dsDNA對其的構(gòu)象識別，同時也要滿足印跡孔穴對其結(jié)構(gòu)、大小及作用位點的互補識別?？疾炝酥匚綍r間對識別4.6× 1010 mol/L西馬特羅的影響，結(jié)果表明，隨著重吸附時間延長，傳感器響應信號強度逐漸降低，并于45 min后趨于穩(wěn)定，表明西馬特羅與dsDNA的結(jié)合及印跡孔穴的結(jié)合達到飽和。因此選擇重吸附飽和時間為45 min。

3.7 傳感器對西馬特羅的分析性能

在最佳實驗條件下，考察了傳感器對不同濃度的西馬特羅溶液響應情況（圖6）。西馬特羅的濃度在1.0×1013～1.0×1010 mol/L范圍內(nèi)，隨著濃度增大，傳感器響應信號強度逐漸降低，且傳感器響應信號強度與西馬特羅濃度呈線性關(guān)系，線性方程為Δi（μA）=9.255lgC-87.47，相關(guān)系數(shù)r=0.9960， 檢出限（3S/K）為3.2×1014 mol/L （0.007 ng/L）。與已報道方法相比，本方法具有較高的靈敏度（表1）。

3.10 實際樣品分析

按照2.4節(jié)的方法對豬肉樣品進行處理，將DNA/MIPs傳感器與樣品待測液孵育45 min，記錄電化學響應信號值。同時，進行加標回收實驗（樣品2加標后超出檢測范圍，經(jīng)稀釋后檢測）。結(jié)果如表2所示，DNA/MIPs傳感器對西馬特羅測定結(jié)果的回收率為94.0%～105.5%，與HPLC法所得結(jié)果一致[31]，表明此傳感器可應用于豬肉樣品中西馬特羅檢測。

4 結(jié) 論

將dsDNA-有機分子的嵌合作用與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，以固化分子印跡孔穴內(nèi)模板分子的空間排列，有效提高了分子印跡膜的識別能力。本傳感器構(gòu)建策略適用于可與DNA進行溝槽式結(jié)合的有機分子的分離測定，為食品等復雜樣品分析檢測提供了一種新方法。

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