呂孟雨 董福雙 張俊敏 王海波

摘 要：農(nóng)桿菌與受體的共培養(yǎng)條件，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化有著重要的作用，為了提高玉米芽生長點(diǎn)的遺傳轉(zhuǎn)化效率，以鄭58玉米自交系的種子為試驗(yàn)材料，用EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）基因作為標(biāo)記基因，通過控制農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)的水分提供方式，研究共培養(yǎng)時(shí)的水分條件對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米芽生長點(diǎn)的影響。結(jié)果表明，將轉(zhuǎn)化的玉米種子放到加有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿放置10～15粒種子，加1.5 mL無菌水，放在25 ℃暗培養(yǎng)3～4 d，在不影響轉(zhuǎn)化效果的基礎(chǔ)上有利于轉(zhuǎn)化后發(fā)芽，可獲得較多的轉(zhuǎn)化材料。

關(guān)鍵詞：玉米；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；共培養(yǎng)；水分

中圖分類號：S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.003

Abstract： The co-culture condition of agrobacterium and its receptor plays an important role in the agrobacterium-mediaed genetic transformation. The purpose of this study is to improve the genetic transformation efficiency of maize bud growth point. Using the seed of maize inbred line Zheng 58 as the experimental material， EGFP （enhanced green fluorescent protein） gene as reporter， and by controlling the water supply in agrobacterium co-culture， the effect of water condition on the growth point of maize germinating was studied. The results showed that when the transformed maize seeds was cultured in petri dishes with 2 layers of filter papers and 10～15 seeds and 1.5 mL sterile water for 3～4 d at 25 ℃ in dark， it was beneficial to germinate after transformation without affecting the transformation effect， and took more transformants.

Key words： maize； agrobacterium-mediated transformation； co-culture； moisture

玉米是全球分布最廣的糧食作物，是世界重要的三大糧食作物之一，也是中國最重要的作物之一[1-2]。轉(zhuǎn)基因玉米作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重大成果，已在世界各地普遍應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因玉米在我國的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用也將是大勢所趨，應(yīng)在技術(shù)上和管理上及早準(zhǔn)備[3]。研究玉米的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)具有重要意義，玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有PEG法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌法、基因槍法、電激法、子房注射法等，其中，農(nóng)桿菌法和基因槍法使用較多[4]。農(nóng)桿菌法具有成本低、外源基因拷貝數(shù)低、外源基因能穩(wěn)定遺傳表達(dá)等特點(diǎn)，更適用于規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系[1]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌侵染外植體必須有一定的時(shí)間，才能使農(nóng)桿菌充分吸附到外植體的表面，此過程中許多因素的變化對轉(zhuǎn)化效率有較大的影響[5-6]。有關(guān)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響因素已有大量研究報(bào)道[5，7-8]，但仍有許多未涉及的問題需要進(jìn)一步探討。

共培養(yǎng)階段是農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段，共培養(yǎng)條件不同將直接關(guān)系轉(zhuǎn)化是否成功，從而影響農(nóng)桿菌對玉米的轉(zhuǎn)化效率，水分是共培養(yǎng)的重要因素之一，在共培養(yǎng)中如何控制水分是研究農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要方面。

玉米莖尖是近幾年遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用的一種受體材料，與幼胚及其胚性愈傷組織等受體材料相比，莖尖作為受體材料具有簡單易行、周期短、效率高、取材不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)。GFP作為輔助性篩選標(biāo)記基因可以直觀、快速和有效地消除玉米遺傳轉(zhuǎn)化工作中的假陽性現(xiàn)象；近幾十年來，GFP綠色熒光蛋白作為可視標(biāo)記在生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用，成為了生物學(xué)研究最重要的手段之一[9]。

本研究利用GFP綠色熒光蛋白作為可視標(biāo)記觀察轉(zhuǎn)化效果，在共培養(yǎng)階段，將已經(jīng)在玉米芽生長點(diǎn)上滴加農(nóng)桿菌侵染液的玉米種子，放到不同的水分狀態(tài)下進(jìn)行共培養(yǎng)，目的是研究共培養(yǎng)時(shí)玉米種子處于不同的水分狀態(tài)下對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的影響，為提高玉米芽生長點(diǎn)的轉(zhuǎn)化效率提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用玉米自交系鄭58的成熟種子，將種子發(fā)芽后剝出的芽生長點(diǎn)作為轉(zhuǎn)化受體。

所用載體PEGAD（Ubi+EGFP）由河北師范大學(xué)提供，含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（EGFP），將35 S啟動(dòng)子替換為ubiquition啟動(dòng)子改造而成（圖1）；所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105，由河北省植物轉(zhuǎn)基因中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子發(fā)芽 將玉米種子清洗后，用0.1%的HgCl2消毒12 min，再用無菌水沖洗5遍，將消毒的種子放在加有2層濾紙經(jīng)過高溫消毒的培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿直徑9 cm），每培養(yǎng)皿放20粒玉米種子，5個(gè)培養(yǎng)皿共100粒種子，每個(gè)培養(yǎng)皿分別加8 mL濃度為70 μmol·L-1的AS（乙酰丁香酮）水溶液，在25 ℃暗培養(yǎng)3 d。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化液的制備 挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到50 mL含有50 mg·L-1硫酸卡那霉素+40 mg·L-1利福平的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，210 rpm條件下振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.5時(shí)，4 000 r·min-1，5 ℃離心5 min收集菌體，棄上清液，懸浮于1 mL的高滲侵染基液。高滲侵染基液配方為：1/10 MS培養(yǎng)基的鹽+ 68.5 g·L-1蔗糖+30 g·L-1葡萄糖+400 mg·L-1 MES +100 μmol·L-1乙酰丁香酮+100 mg·L-1普朗尼克F68，pH值為5.4～5.6，搖勻制備成農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化液。

1.2.3 轉(zhuǎn)化處理與檢測 當(dāng)玉米種子浸種發(fā)芽3 d以后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，將發(fā)芽的種子在4 ℃冷處理31 h，然后在工作臺(tái)上放置30 min，用手術(shù)刀剝出玉米芽生長點(diǎn)。處理1：放入加有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，處理1共轉(zhuǎn)化3個(gè)培養(yǎng)皿，每培養(yǎng)皿放10粒種子，在-18 ℃處理20 min，放置30 min，用農(nóng)桿菌侵染液轉(zhuǎn)化處理，轉(zhuǎn)化30 min后，加1.5 mL水，蓋蓋后密封，放在23～25 ℃溫度條件下暗培養(yǎng)4 d，然后每培養(yǎng)皿加10 mL水，25℃光照培養(yǎng)。處理2：將剝出生長點(diǎn)的玉米種子放入1 mL的槍頭盒中，其中一盒放20粒種子，另一盒放17粒種子，在-18 ℃處理20 min，放置30 min，用農(nóng)桿菌侵染液轉(zhuǎn)化處理，轉(zhuǎn)化30 min后，每盒加20 mL水，蓋蓋后密封，放在23～25 ℃溫度條件下暗培養(yǎng)4 d，然后每槍頭盒加20 mL水，進(jìn)行光照培養(yǎng)1 d，轉(zhuǎn)接到加有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿放10粒種子加10 mL水，進(jìn)行光照培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化7 d后，用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)化芽進(jìn)行熒光蛋白檢測，比較2個(gè)處理的轉(zhuǎn)化效果和轉(zhuǎn)化芽的獲得情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 共培養(yǎng)條件對玉米發(fā)芽的影響

轉(zhuǎn)化后經(jīng)過共培養(yǎng)6 d后玉米種子的出芽率，處理1為43.3%，處理2為12.5%；玉米種子的芽長度處理1較長，處理2很短（圖2c），說明處理2對轉(zhuǎn)化后玉米種子的發(fā)芽不利，獲得的轉(zhuǎn)化玉米芽較少。由此可見，使玉米種子直接接觸一定的水分（處理1），比只在濕度較大的水環(huán)境中（處理2）更有利于發(fā)芽。

2.2 共培養(yǎng)條件對轉(zhuǎn)化的影響

通過對轉(zhuǎn)化芽綠色熒光蛋白的檢測結(jié)果可知（圖3），處理1與處理2轉(zhuǎn)化后長出的玉米芽綠色熒光蛋白的表達(dá)亮度差異不明顯，表明這2種共培養(yǎng)方式對于農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化效果基本沒有差異，農(nóng)桿菌對玉米芽生長點(diǎn)的轉(zhuǎn)化需要的水分并不多，只要有一定的濕度即可完成侵染轉(zhuǎn)化過程，但水分過少時(shí)轉(zhuǎn)化后生長出的芽小，不利于轉(zhuǎn)化苗的形成。

3 討 論

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌中T-DNA 攜帶外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期。張麗君等[10]將第2 次超聲處理后的微創(chuàng)傷種子浸泡在含有目的基因農(nóng)桿菌菌液中，于搖床上振蕩（ 120 r·min-1） 培養(yǎng)1～3 d，由于轉(zhuǎn)化材料為種子，需要考慮種子的發(fā)芽情況，共培養(yǎng)時(shí)間以2 d 較合適；共培養(yǎng)時(shí)間太短，農(nóng)桿菌沒有充分地對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率較低；而共培養(yǎng)時(shí)間太長，胚細(xì)胞呼吸作用逐漸加強(qiáng)，酶的活動(dòng)逐漸旺盛，加速消耗氧氣，使得共培養(yǎng)液中氧氣含量減少，營養(yǎng)情況不良，并容易大量產(chǎn)生、積累次級代謝產(chǎn)物，可能產(chǎn)生有害物質(zhì)。由于他們利用農(nóng)桿菌液與受體材料進(jìn)行共培養(yǎng)，使得共培養(yǎng)時(shí)間不宜超過2 d，采用將農(nóng)桿菌侵染液添加到玉米芽生長點(diǎn)上，向培養(yǎng)皿中添加少量的水，使玉米種子可以吸收到少量水分保持一定濕度，又不影響種子正常呼吸作用，這樣進(jìn)行共培養(yǎng)，可以使共培養(yǎng)的天數(shù)增加到3～4 d，保證有充分的時(shí)間完成農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化過程，使更多的細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化，又不會(huì)危害芽的生長。如果不使種子接觸到水分，僅保證種子處于較高的濕度環(huán)境，雖然可以完成農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化但對轉(zhuǎn)化芽的生長不利，不易獲得轉(zhuǎn)化植株。采用加較少的水分，在培養(yǎng)皿中密閉的方法共培養(yǎng)，有利于農(nóng)桿菌完成轉(zhuǎn)化和獲得植株。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉允軍，賈志偉，劉艷，等.玉米規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建及其應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 47（21）： 4172-4182.

[2]張潔，周巖.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究進(jìn)展與對策[J].生物技術(shù)通報(bào)， 2013（5）：7-14.

[3]沈平， 章秋艷，林友華， 等.推進(jìn)我國轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化的思考[J].中國生物工程雜志， 2016， 36（4）： 24-29.

[4]袁鷹，李啟云，郝文媛，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化影響因子的研究[J].分子植物育種，2006，4（2）：228-232 .

[7]李曉麗，王建軍， 崔瑞潔，等. 大豆鐵蛋白基因GmFerritin 在玉米中的遺傳轉(zhuǎn)化[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 39（2）： 263-268.

[5]鄒湘輝， 莊東紅 ，胡忠， 等. 負(fù)壓和超聲波處理對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響[J].中國油料作物學(xué)報(bào)， 2004， 26（1）： 12-16.

[8]白云鳳，王國英，茍明月，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)基因的影響因素研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，14（3）：173-175.

[6]王關(guān)林， 方宏筠. 植物基因工程[M] . 北京： 科學(xué)出版社， 2002： 734-735.

[9]段學(xué)清，鄭莉茹，劉文波，等. GFP綠色熒光法輔助篩選玉米轉(zhuǎn)基因植株[J].玉米科學(xué)2017，25（2）：31-38.

[10]張麗君， 劉龍龍， 張建珍， 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)創(chuàng)傷胚轉(zhuǎn)化的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（3）： 25-28.