宋一祎，李華茵

復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是由曲霉菌侵入肺組織所引起的深部真菌感染性疾病，以發(fā)展成壞死性、出血性肺炎，形成多發(fā)性膿腫或肉芽腫，病灶邊緣有小動脈栓塞為特征。致病菌主要有煙曲菌、黃曲菌、黑曲菌、土曲菌及構(gòu)巢曲菌，其中以煙曲菌最為常見。IPA主要發(fā)生于免疫抑制人群，常見的宿主有：>10 d的中性粒細胞缺乏患者(中性粒細胞計數(shù)小于0.5×109/L)；接受同種異體造血干細胞移植或?qū)嶓w器官移植患者；長期應用糖皮質(zhì)激素患者(平均應用最小劑量相比潑尼松為0.3 mg/kg/d，持續(xù)3周以上)；細胞免疫抑制療法患者，如應用環(huán)孢素、腫瘤壞死因子α(TNF-α)阻滯劑、特異性單克隆抗體以及核苷類似物；遺傳的免疫缺陷狀態(tài)(慢性肉芽腫性疾病和嚴重的聯(lián)合免疫缺陷病)或獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者[1]。這類患者占侵襲性肺曲霉病的80%以上。

近年來，IPA的發(fā)病率大大增加。有研究[2]顯示，1978至1992年，在院內(nèi)經(jīng)尸檢證實的IPA患者比例從9%升高至32%；同時IPA死亡率也迅速上升，病死率達80%，在器官移植患者中達95%。該研究表明，早期診斷并及時開展抗真菌治療可使侵襲性真菌病的生存率提高80%以上，亟待解決的問題是找到一種能早期診斷且靈敏度高、特異度高的診斷方法。目前臨床上主要采用歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)推薦的侵襲性真菌病的分級診斷標準[3]：確診IPA有賴于組織病理學依據(jù)或正常無菌部位標本曲霉菌培養(yǎng)陽性或直接鏡檢陽性。臨床診斷病例需要有宿主因素、臨床依據(jù)和微生物學證據(jù)，其中根據(jù)是否有微生物學證據(jù)劃分為probable(很可能)IPA和possibie(可能)IPA。微生物學證據(jù)在IPA的診斷中至關重要，主要通過實驗室檢測獲得，目前侵襲性肺曲霉病的實驗室檢測方法主要有半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)試驗、(1,3)-β-D葡聚糖(BDG)試驗(G試驗)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術、免疫層析側(cè)流裝置(lateral-flow device,LFD)技術及一些新興的實驗室檢測方法[4-5]。本文就此類檢測方法診斷IPA作一綜述。

1 GM抗原檢測

GM是曲霉菌細胞壁特異的組成部分，在曲霉菌侵犯組織早期可釋放人血，并且這種抗原血癥可持續(xù)1～8周。因此，GM在血清中出現(xiàn)較早且存在時間較長，特異度和靈敏度相對較高，對IPA的早期診斷及治療監(jiān)測更有價值。GM試驗在粒細胞缺乏患者中的診斷價值被多項研究證實，文獻[6-7]報道其診斷的靈敏度和特異度分別為61%～89%和84%～95%。而最近一項在非粒細胞缺乏患者中開展的研究[8]表明，血清GM試驗診斷的靈敏度和特異度分別為37.84%和87.14%，支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage, BAL)液GM試驗的靈敏度和特異度分別為75.68%和80.72%(當ODI值>0.5為陽性臨界值時)。但GM試驗目前存在的缺點在于：(1)GM檢測有假陽性干擾，如使用哌拉西林三唑巴坦后血清GM會出現(xiàn)陽性，可能與某些交叉反應有關。(2)其特異度和靈敏度波動范圍大，并極大地依賴于測試的人群、檢測標本的種類以及抗真菌藥的使用，如血液惡性腫瘤患者或接受過造血干細胞移植的患者GM試驗的靈敏度高于免疫功能正常的患者(可能與免疫正常宿主對侵入血管的曲霉菌清除有關)；使用經(jīng)驗性或預防性抗真菌藥物治療后GM試驗的靈敏度降低；BAL液與血清相比，GM試驗靈敏度更高。(3)盡管GM試驗已經(jīng)應用了很長時間，但其陽性結(jié)果的最佳臨界值仍尚未確定，因此為臨床應用帶來了些許不足。目前較多研究[9-10]采用血清GM試驗ODI值>0.5、BAL液GM試驗ODI值>1.0作為陽性臨界值，但也有少數(shù)研究[11]表明當BAL液GM試驗ODI臨界值為0.8時，具有最大的ROC曲線下面積(AUC)。

2 BDG檢測

BDG是大部分真菌細胞壁的共同成分(接合菌、隱球菌除外)，檢測血循環(huán)或BAL液中的BDG可對系統(tǒng)性真菌感染進行篩查，此法靈敏度可達1 ng/L，特異度高，有著極佳陰性預測值。近期的一項Meta分析[12]顯示，G試驗在診斷真菌感染中的靈敏度和特異度分別為77%和85%。而G試驗缺點在于：(1)無法區(qū)分真菌種類。(2)早期診斷意義不大，對抗真菌治療患者進行連續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)BDG在治療中期才高濃度出現(xiàn)在血液中，所以BDG雖然可以監(jiān)測病情變化和抗真菌治療效果，但血液峰濃度出現(xiàn)較遲。(3)檢測結(jié)果容易受多種因素影響，常見的干擾因素有應用纖維素膜進行的腹膜透析治療，應用靜脈制劑(白蛋白、免疫球蛋白等)、紗布或其他醫(yī)療物品(外科手術)及某些細菌敗血癥等。(4)某些曲霉菌種，如毛曲霉菌的細胞壁不含有BDG，限制了G試驗對該種曲霉的檢測。

3 PCR技術

PCR是在體外模擬體內(nèi)核酸復制從而獲得大量目的基因的技術，于20世紀90年代開始應用于曲霉菌DNA檢測，檢測靶點主要包括曲霉核糖體DNA(ribosomal DNA, rDNA)以及線粒體DNA[13]。由于PCR反應具有靈敏度高，反應周期較傳統(tǒng)培養(yǎng)、GM試驗短的特點，被認為是一種極有前景的診斷方法。然而，PCR技術檢測曲霉菌存在方法學標準化困難，對實驗場地的配置、實驗操作規(guī)范性、操作人員的要求較高，以及傳統(tǒng)PCR、巢式PCR技術存在容易污染樣本，假陽性率高，不能量化等缺點，未能大規(guī)模應用。

實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)的出現(xiàn)彌補了這一不足：RT-qPCR是在傳統(tǒng)PCR基礎上加入信號系統(tǒng)達到實時監(jiān)測PCR擴增的目的，繼承了傳統(tǒng)PCR高靈敏度和操作簡便的特點，同時實現(xiàn)了對樣本的定量檢測。根據(jù)信號基團的不同，RT-qPCR可以分為染料法和探針法[14]。非特異的染料法成本較低，但面臨著類似于普通PCR非特異性擴增產(chǎn)物干擾的假陽性問題；探針法中使用的探針多是 TaqMan探針，與染料法相比，假陽性出現(xiàn)概率更低[15]。此外，歐洲曲霉PCR行動委員會(European aspergillus PCR initiative, EAPCRI)關于曲霉DNA提取方式、PCR擴增方案、樣本種類及數(shù)量、反應條件和體系等的標準化操作建議不斷被完善[16-17]，例如推薦當使用全血標本時應使用≥3 mL全血，需先裂解紅細胞和白細胞；提取DNA所用的洗脫液應小于100 μL，并設置陽性對照和陰性對照等。

2014年，Arvanitis等[18]發(fā)表了一項包含25項研究、2 595個病例的meta分析，旨在評價PCR技術在高危血液系統(tǒng)疾病患者血液樣本(包括全血和血漿)中的診斷價值，結(jié)果顯示：PCR診斷試驗在血液樣本中的靈敏度和特異度分別為84%和76%；當同一患者至少2個樣本PCR試驗陽性時，陽性似然比為12.8。2016年，Imbert等[19]研究證實了這一結(jié)論，該研究納入了來自941例患者(其中51例患者被診斷為確診/很可能IPA)的5 146個血清樣本，結(jié)果表明血清PCR陽性診斷IPA的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為66.7%、98.7%、75.6%和98.0%，與血清GM試驗相比，PCR試驗受粒缺和非粒缺因素影響更小，假陽性率更低。在疾病監(jiān)測方面，當樣本DNA載量以150拷貝/mL為臨界值時，對患者90 d死亡率可能性高低具有很好的區(qū)分價值。該研究還發(fā)現(xiàn)，當結(jié)合GM試驗和PCR試驗(二者之一陽性即為陽性標準)時，診斷IPA的靈敏度可高達88.2%。

PCR試驗在BAL液中的靈敏度被認為比血液標本中更高，與之相關的機制可能是：(1)BAL液標本是從病灶鄰近處獲取，因此曲霉菌載量更高。(2)從曲霉初始感染至入侵肺泡毛細血管壁往往需要24 h左右，因此BAL液檢測相比于血液學檢測更有利于早期診斷[20]。在一項包含了116例患者的多中心的回顧性臨床研究[21]中，發(fā)現(xiàn)PCR診斷試驗在BAL液中的靈敏度和特異度分別為78%和79%，其靈敏度結(jié)果與2007年的一項關于PCR在BALF中診斷價值的meta分析[22]結(jié)果相近(靈敏度79%，特異度94%)，然而特異度卻有所下降，可能與使用巢式PCR法、樣本被污染、無法區(qū)分是定植或感染有關。而2016年的一項采用RT-qPCR法檢測BAL液中曲霉菌的研究[23]表明，在BAL液樣本中，qPCR和GM試驗都具有良好的靈敏度(90%vs90 %)；但是qPCR的特異性明顯高于GM試驗(92.5%vs68.8%，P<0.001)。分析這一結(jié)果與前者不同的原因在于，由于實現(xiàn)了實時熒光定量，原始樣本的DNA拷貝濃度與最后的熒光循環(huán)閾值(ct)值相關，從而可以更好地區(qū)分定植與感染。由此可見，當使用設計良好、試驗過程精確定量的qPCR方法來檢測曲霉DNA時，無論其靈敏度和特異性均優(yōu)于GM試驗。

此外，PCR技術目前也可用于活檢組織的曲霉DNA檢測，是對傳統(tǒng)組織培養(yǎng)及鏡檢的一種補充性診斷方法，并且有助于真菌種屬的鑒別[24-25]。關于PCR技術在胸腔積液、痰液等體液標本中的診斷價值相關文獻報道甚少，有待進一步研究。

4 LFD技術

2008年，Thornton[26]利用煙曲霉的凍干菌絲免疫小鼠，制備了一株單克隆抗體MAb JF5，其針對的抗原是一種糖蛋白，該體外研究表明，該糖蛋白在曲霉快速活躍生長期連續(xù)分泌，其主要分布在菌絲細胞壁、胞間隔和圍繞細胞的莢膜層中。LFD是利用該抗體研發(fā)的一種快速診斷IPA的免疫層析側(cè)流裝置，為膠體金顆粒標記的MAb JF5作為檢測試劑加載到膠體金結(jié)合墊上，同時未標記的MAb JF5被固定在硝酸纖維膜的捕獲區(qū)。血清或BAL液中的抗原加入樣品墊后，由于虹吸作用向前移動，首先與金標抗體結(jié)合，膠體金-抗體-抗原復合物移動到捕獲區(qū)，再與固定的MAb JF5結(jié)合，形成一條肉眼可見的紅線，顯色強度與抗原濃度成正比，檢測結(jié)果被判為陰性、弱陽性、中等陽性或強陽性。測試結(jié)果在加樣后10～15 min后即可觀測。

2012年12月至2013年5月，Hoenigl等[27]收集了來自澳大利亞和德國兩所教學醫(yī)院的78個病例(具有IPA的危險因素)，采集了78份BAL液樣本，結(jié)果顯示LFD試驗診斷的靈敏度和特異度分別為80%和95%，陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)也分別為80%和95%，診斷優(yōu)勢比為78。然而在隨后開展的一項自2013年5月至2014年12月的研究[28]中，對來自72例患有血液系統(tǒng)腫瘤患者的95份BAL液樣本進行了分析，發(fā)現(xiàn)LFD的靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為71%、76%、35%和94%。分析LFD試驗的靈敏度有所下降可能與納入人群的特點有關(前者在收集BAL液的同時較少受抗真菌治療的影響)。此外，類似于PCR試驗，當結(jié)合BAL液的GM試驗和LFD試驗作為聯(lián)合診斷措施時，IPA的靈敏度可達94%，特異度可達93%，診斷優(yōu)勢比可達219[29-30]。由此看來，LFD試驗具有簡便、快速的特點，且診斷價值較好，尤其具有良好的陰性預測價值。

關于LFD的IPA診斷價值還存在許多亟待解決的問題。首先，LFD是定性試驗，陽性結(jié)果判讀完全依賴操作人員的主觀評估，可能會造成結(jié)果的偏差；其次，目前關于LFD的研究檢測樣本僅限于血液和BAL液，沒有對尿液等其他體液進行檢測，而且上述實驗還未經(jīng)大量臨床樣本驗證；最后，關于LFD試驗的商業(yè)化檢測目前還存在困難。因此，LFD在臨床上應用的推廣還需進一步的探討。

5 其他診斷方法

5.1 醋酸鐮孢氨酸C(triacetylfusarinine C, TAFC) TAFC是煙曲霉菌在感染宿主后轉(zhuǎn)運鐵過程中產(chǎn)生的一種分泌型的小分子螯合劑。在一項包含44個BAL液樣本的研究[31]中，TAFC檢測的靈敏度、特異度、PPV、NPV分別為40%、79%、50%和72%。但當結(jié)合TAFC和GM試驗結(jié)果時，其診斷IPA的靈敏度可達87%。但由于TAFC在其他一些真菌(鐮孢菌的成熟期)也可檢測到，因而不具有曲霉特異性。此外，關于這種新型標志物最佳臨界值以及在其他體液標本中的表現(xiàn)等需要后續(xù)更多的研究來證實。

5.2 二甲硫基膠霉素(bis-methylthio gliotoxin, bmGT) 膠霉毒素作為煙曲霉產(chǎn)生的真菌毒素之一，對哺乳動物細胞具有免疫抑制及促凋亡作用。其通過抑制NAPDH氧化酶活性進而抑制粒細胞抗微生物作用。在侵襲性曲霉病動物模型和臨床確診患者血清中均可檢測到膠霉毒素，預示其可作為曲霉病診斷指標。而bmGT是膠霉素甲基化產(chǎn)生的一種更為穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物。Vidal-García等[32]做了一項來自90例高危患者的357個血清樣本檢測，發(fā)現(xiàn)血清bmGT的靈敏度、特異度、PPV、NPV分別為61.5%、93.0%、25.0%和98.5%，與GM試驗相結(jié)合時，PPV和NPV分別可達100%和97.5%。是一種頗有前景的血清標志物，但仍需大量研究證實。

5.3 電子鼻(eNose) eNose是動物嗅覺系統(tǒng)研究成果、傳感器技術與電子學和計算機技術結(jié)合的產(chǎn)物，主要由具有部分選擇性的傳感器陣列和模式識別系統(tǒng)組成，是一種通過傳感器的部分專一性和系統(tǒng)的模式識別功能，來檢測簡單或復雜氣味的電子儀器。其廣泛用于生物的鑒別、藥物的分類與判別。臨床上，eNose可通過分析呼出氣中包含的各種揮發(fā)性有機化合物的不同從而鑒別不同的肺部疾病，數(shù)分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。Heer等[33]開展的一項單中心、前瞻性研究中，包含了46例受試者，結(jié)果顯示，交叉驗證后的eNose診斷的靈敏度和特異度分別為100%和83.3%。AUC為0.93。該研究存在的問題是，樣本量太小，需要進一步加大樣本量來驗證這一結(jié)論；其次，eNose得到的信息代表所測樣品中全部揮發(fā)物的總體分布，而不是常規(guī)儀器的分析測得的某種或某幾種具體組成的含量，無法區(qū)分是曲霉感染后產(chǎn)生的哪一種或哪幾種氣體導致了氣體指紋的不同；另外，電子鼻價格昂貴，從“臺式”到“手持式”價格也從一萬美元至十多萬美元不等。

5.4 呼出氣冷凝液(exhaled breath condensate, EBC)試驗 EBC試驗實際上也是檢測EBC中的GM含量，相較于檢測BAL液的GM試驗而言，創(chuàng)傷更小。但是其檢測效果還不能確定。最近由Bhimji等[34]開展的一項在肺移植者中進行的前瞻性研究表明，相對于健康人，患者EBC中的GM含量更高(P<0.0001)。然而，檢測EBC中的GM未能得出一個有效的界定值(AUC只有0.46)。并且該研究還發(fā)現(xiàn)，EBC中GM試驗和同時采集的BAL液中GM試驗的結(jié)果并無相關性。

5.5 質(zhì)譜分析法 真菌在感染宿主細胞的過程中會產(chǎn)生一系列真菌毒素，其中最具有殺傷力的是一種被稱為真菌鐵載體的蛋白?；|(zhì)輔助-激光解吸電離質(zhì)譜分析法可以檢測血液、尿液以及肺組織中此種蛋白的含量，檢測極限可達到0.28～0.36 ng/mL，特別是在組織標本中檢測這種由真菌代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，可減少由直接鏡檢得出的假陽性結(jié)果。這種檢測方法具有很好的應用前景，但目前缺少在人群研究中的證實。

6 小 結(jié)

IPA的早期診斷仍然是臨床上的一個難題。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)及顯微鏡檢查方法是確診曲霉菌感染的金標準，但由于其陽性率低，培養(yǎng)周期長已經(jīng)不適合臨床工作；而GM試驗已得到廣泛應用，且被EORTC/MSG納入微生物學證據(jù)之一，肯定了其診斷IPA的價值，但存在易受患者疾病狀態(tài)影響、抗真菌療法干擾及某些藥物影響的不足。此外，qPCR及LFD同樣具有不低于GM試驗的診斷價值，且操作更簡便，診斷時間更短，有利于指導及監(jiān)測抗真菌治療，但由于存在標準化操作流程尚未統(tǒng)一、最佳臨界值無法確定及商業(yè)化試劑的缺乏等缺點，限制了在臨床上的應用。一些新興診斷方法為IPA的診斷提供了思路，但仍需要更多相關研究證實。結(jié)合多種試驗可以顯著提高IPA的診斷效率，這一結(jié)論已經(jīng)在多項研究中得到證實，為后續(xù)的研究及臨床應用提供了方向。