王玲利

[摘 要]人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）具有低免疫原性，自我更新、增殖和多向分化的潛能；hUCMSCs具有來源廣泛、可塑性強(qiáng)、對(duì)供者無不利影響、無倫理限制問題等優(yōu)勢(shì)，使其成為組織工程、造血干細(xì)胞移植、細(xì)胞治療和基因治療中極具潛力的種子細(xì)胞，在研究及臨床應(yīng)用方面也有十分廣闊的前景。

[關(guān)鍵詞]人臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；移植治療

中圖分類號(hào)：S785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2018）02-0324-02

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）根據(jù)其來源主要分為，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）的特性類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），因其增殖和分化潛能比BMSCs更高，獲取過程為非侵襲性，來源豐富、取材方便而成為科研和臨床工作中干細(xì)胞的一個(gè)較好來源。本文就近幾年國內(nèi)外關(guān)于hUCMSCs的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 hUCMSCs的來源

人臍帶由三部分構(gòu)成：羊膜被覆上皮、臍血管和位于兩者之間被稱為華氏膠的胚胎黏液結(jié)締組織。Mitchell[1]首次從華氏膠中提取出一種成纖維樣細(xì)胞，并證實(shí)了該類細(xì)胞具有多向分化的潛能。Romanov 等首先證明了臍帶組織中含有干細(xì)胞。隨后多位研究者從臍帶華氏膠中分離到這種成纖維樣細(xì)胞，證實(shí)其具有自我更新、增殖和多向分化的潛能，并命名為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）。

2 hUCMSCs的分離培養(yǎng)

2.1 hUCMSCs的分離

目前hUCMSCs 的分離方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法兩種。其中，在分離培養(yǎng)的早期，酶消化法獲得的細(xì)胞數(shù)量更多，但含有其他類型的細(xì)胞，需要標(biāo)記分離純化；組織塊貼壁法操作比較簡單，且傳代后的細(xì)胞形態(tài)及增殖活性更加穩(wěn)定，污染機(jī)會(huì)更小，培養(yǎng)體系中幾乎沒有造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞等。

2.2 hUCMSCs的培養(yǎng)

常用的hUCMSCs培養(yǎng)基為α-MEM或者低糖DMEM中加10%的胎牛血清、生長因子、抗生素和營養(yǎng)物質(zhì)等，在5%CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d需要更換一次培養(yǎng)液，原代培養(yǎng)大約2周，當(dāng)貼壁細(xì)胞80～90%融合時(shí)，就可按1：3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2～3d后就可得到較為純凈且均勻一致的細(xì)胞系。研究顯示，酸性培養(yǎng)基Mesencult更有利于臍帶血細(xì)胞的生長，并能形成克??；經(jīng)低強(qiáng)度脈沖式超聲波處理的臍帶及傳代細(xì)胞，在同等條件下能獲得對(duì)照組3倍數(shù)量的細(xì)胞，并且細(xì)胞的擴(kuò)增能力明顯增強(qiáng)，但持續(xù)的低強(qiáng)度超聲波反而會(huì)降低細(xì)胞的增殖能力[2]。

3 hUCMSCs的生物學(xué)特性

3.1 hUCMSCs的細(xì)胞形態(tài)

分離得到hUCMSCs后，培養(yǎng)24h，可在倒置顯微鏡下觀察到貼壁形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，呈平行排列生長或者旋渦狀生長，在低密度時(shí)較扁平，密度增加趨于融合時(shí)細(xì)胞就變得細(xì)長，也可觀察到多角形的細(xì)胞。掃描電鏡下觀察到細(xì)胞呈長條狀纖維樣，表面不光滑，細(xì)胞有小結(jié)節(jié)狀物，無明顯突起，細(xì)胞間無網(wǎng)狀連接。

3.2 hUCMSCs的生長、增殖特點(diǎn)

細(xì)胞的原代培養(yǎng)一般需要10～14d，待細(xì)胞融合達(dá)80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，接種后2～4d增長趨勢(shì)最為明顯。對(duì)細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，第2～6代的hUCMSCs為正常的二倍體細(xì)胞，80%的細(xì)胞處于G0～G1期，處于活躍增殖期的細(xì)胞較少。早期細(xì)胞生長呈增長的趨勢(shì)，潛伏期一般不超過36h，之后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，一般持續(xù)到第6～8d，之后進(jìn)入平臺(tái)期，呈現(xiàn)典型的“S”型增長方式。

3.3 hUCMSCs的免疫表型及免疫標(biāo)記

目前研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs沒有特異的表面抗原，但可形成表面蛋白作為抗原標(biāo)記，4～8代的hUCMSCs表面標(biāo)記較為穩(wěn)定。通常hUCMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記和黏附分子標(biāo)記，低表達(dá)移植相關(guān)的表面標(biāo)記MHC-I類分子標(biāo)記等，弱表達(dá)CD106，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記、單核巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記CD14及與淋巴功能相關(guān)的抗原lαCD11a，也不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子標(biāo)記及CD80、DC86等HLA抗原識(shí)別有關(guān)的共刺激因子。大量研究表明hUCMSCs是更原始的間充質(zhì)干細(xì)胞群，可能具有更強(qiáng)的可塑性和極低的免疫原性，類似于稀少的成人多能祖細(xì)胞。

3.4 hUCMSCs的免疫原性

hUCMSCs具有極低的免疫原性和誘導(dǎo)免疫耐受能力。研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs低表達(dá)HLA-ABC，不表達(dá)HLA-DR，也不表達(dá)共激分子CD80和CD86，而細(xì)胞表面共激分子是T細(xì)胞活化劑增殖過程中必需的信號(hào)系統(tǒng)。在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UCMSCs不刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖，還可以顯著抑制小鼠淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。以上研究說明hUCMSCs不僅具有較低的免疫原性，還能抑制免疫活性細(xì)胞的增殖。

3.5 hUCMSCs的分化潛能

hUCMSCs具有強(qiáng)大的多向組織分化能力，可向外胚層、中胚層及內(nèi)胚層細(xì)胞分化。大量研究證實(shí)，hUCMSCs在體內(nèi)可分化為神經(jīng)細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、光敏感感受神經(jīng)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞等；在體外可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞及生殖細(xì)胞等[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶（ALP）活性增高（未誘導(dǎo)的臍帶貼壁細(xì)胞中無ALP），并表達(dá)骨涎蛋白（ON），證實(shí)了hUCMSCs具有成骨潛能。誘導(dǎo)hUCMSCs向多巴胺神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的研究表明，絡(luò)氨酸羥化酶（TH）陽性標(biāo)志率為12.7%，而培養(yǎng)基中有多巴胺釋放。將來自臍動(dòng)脈、臍靜脈及全部臍帶的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，三種來源的細(xì)胞均有肌成纖維細(xì)胞的活性。Baksh發(fā)現(xiàn)hUCMSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)可產(chǎn)生豐富的脂肪小滴，Wang研究表明hUCMSCs可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。

4 hUCMSCs的移植應(yīng)用

近年來，hUCMSCs在細(xì)胞替代治療和再生醫(yī)學(xué)、組織工程學(xué)等應(yīng)用領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，在體外誘導(dǎo)hUCMSCs分化及動(dòng)物體內(nèi)移植等方面取得了令人矚目的成績，為臨床應(yīng)用的可行性、安全性提供了可靠的理論支撐和實(shí)踐基礎(chǔ)。

4.1 hUCMSCs在組織工程中的應(yīng)用

有研究者利用hUCMSCs在血管生物反應(yīng)器內(nèi)成功構(gòu)建出了人工血管，而通過透射鏡及組織學(xué)等檢測發(fā)現(xiàn)該人工血管的形態(tài)和機(jī)械強(qiáng)度均與人的肺動(dòng)脈相接近。Kadber等將hUCMSCs接種于PGA/P4HB生物聚合體上能產(chǎn)生大量的種子細(xì)胞，且細(xì)胞的增殖速度明顯增加。

4.2 hUCMSCs移植治療神經(jīng)疾病

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，但目前尚無神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)和再生的有效措施，外源性細(xì)胞替代治療是神經(jīng)修復(fù)重建的有效治療策略之一。

將hUCMSCs移植入光感受器退變老鼠的視網(wǎng)膜下，hUCMSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)視覺的修復(fù)有很大的作用，尤其是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），能有效地修復(fù)視覺功能[4]。hUCMSCs也有向大腦缺血區(qū)域遷移的能力，在損傷區(qū)域向膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化，促進(jìn)損傷部位血管及神經(jīng)的再生。有研究認(rèn)為是源于hUCMSCs的神經(jīng)保護(hù)以及它分泌的各種營養(yǎng)因子在機(jī)體損傷修復(fù)中起到重要作用，也有學(xué)者認(rèn)為在hUCMSCs衍生的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)下，干細(xì)胞整合素的表達(dá)增強(qiáng)才是hUCMSCs移植后缺血大腦神經(jīng)損傷修復(fù)的關(guān)鍵因素。但目前關(guān)于hUCMSCs改善大腦缺血癥狀的機(jī)制還沒有統(tǒng)一結(jié)論，有待進(jìn)一步的研究。

另外，hUCMSCs在治療脊髓損傷中也有顯著的效果，移植到宿主損傷脊髓后可促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。Yang發(fā)現(xiàn)，UCMSCs有助于完全性橫貫性脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善；未經(jīng)體外誘導(dǎo)的hUCMSCs可在脊髓損傷的大鼠體內(nèi)向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，減少膠質(zhì)瘢痕，促進(jìn)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能的恢復(fù)[5]?？梢姡琱UCMSCs為治療腦缺血、脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病提供了廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 hUCMSCs移植治療心血管疾病

心肌細(xì)胞缺乏再生能力，在局部缺血損傷時(shí)心肌細(xì)胞的死亡會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，采用健康人的不同干細(xì)胞替代治療并增強(qiáng)心臟功能成為細(xì)胞工程治療的研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)，hUCMSCs在經(jīng)過5-氮胞苷誘導(dǎo)后可分化為心肌細(xì)胞，表達(dá)鈣黏蛋白和心肌鈣蛋白Ⅰ，在形態(tài)學(xué)上可以觀察到誘導(dǎo)分化后的hUCMSCs能產(chǎn)生自律搏動(dòng)，說明hUCMSCs可分化成心肌細(xì)胞，可以作為心肌細(xì)胞的來源。

高連如等[6]把hUCMSCs移植于由冠心病引起的慢性心臟功能衰竭者，移植2周后發(fā)現(xiàn)，患者心功能左室射血分?jǐn)?shù)提高了13%，患者夜間能夠平臥入眠，并無陣發(fā)性呼吸困難的現(xiàn)象。將來源于hUCMSCs和臍血的內(nèi)皮細(xì)胞移植到人工心瓣膜支架上，利用生物效應(yīng)器模擬體內(nèi)心瓣膜的工作環(huán)境，再通過生物與機(jī)械刺激作用，可獲得具有活力的人造心瓣膜，且該瓣膜表現(xiàn)出成熟的分層組織結(jié)構(gòu)及含有功能的內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)物，可見，hUCMSCs可在組織工程中作為人工心瓣膜的來源。

4.4 hUCMSCs與糖尿病和腫瘤病

將hUCMSCs移植到患糖尿病的大鼠體內(nèi)，60d后能在大鼠胰島腺中檢測出人胰島素基因，說明hUCMSCs具有向胰島樣細(xì)胞分化的潛能。在體外將hUCMSCs誘導(dǎo)成胰島小島樣細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞可表達(dá)胰島以及胰島β細(xì)胞的相關(guān)基因，將其移植入糖尿病老鼠模型，可以大大降低血糖水平，有效改善老鼠體重減輕的癥狀，并沒有移植排斥反應(yīng)發(fā)生，表明hUCMSCs能分化為成熟的胰島β樣細(xì)胞，在Ⅱ型糖尿病中可作為胰島β細(xì)胞替代治療的理想來源。

研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs可向人乳腺癌細(xì)胞（MDA231）遷移，腫瘤細(xì)胞分泌的化學(xué)增活素SDF-1、VEGF等能刺激hUCMSCs向腫瘤細(xì)胞遷移，由此可知，hUCMSCs可作為腫瘤藥物載體做靶向治療。研究還表明，hUCMSCs通過下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路AKt和MAPK，以刺激內(nèi)在凋亡通路，從而減輕腫瘤細(xì)胞的負(fù)荷。

4.5 hUCMSCs與生殖系統(tǒng)疾病和肝臟疾病

hUCMSCs在精原細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)可使其由成纖維細(xì)胞形變?yōu)閳A形，并有少數(shù)圓形的細(xì)胞分化呈蝌蚪狀，而且能表達(dá)精原細(xì)胞的特征性標(biāo)記CD117和CD49f，證實(shí)了hUCMSCs具有向精原細(xì)胞分化的潛能，這就有可能為男性不育患者提供了干細(xì)胞來源和新的治療途徑。

研究顯示，利用肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)hUCMSCs向肝細(xì)胞分化，分化的細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)記物CK18、CK19、ALB和AFP，糖原PAS染色呈現(xiàn)陽性，說明了誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有干細(xì)胞的性質(zhì)。目前研究表明，hUCMSCs在體外、體內(nèi)均可誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞，為臨床上治療急性肝衰竭、慢性終末期肝病提供了新思路。

4.6 hUCMSCs與免疫系統(tǒng)疾病

MSCs對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)主要涉及T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。MSCs通過抑制細(xì)胞的分裂來抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。研究表明MSCs通過減少間充質(zhì)相關(guān)抗原CD1a、CD86、HLA-DR 的表達(dá)來抑制單核細(xì)胞向DC的分化，從而調(diào)節(jié)免疫功能。MSCs作為一種新興的干細(xì)胞，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，為異基因造血干細(xì)胞移植和自身免疫性疾病的治療開辟新道路。

5 前景及展望

研究表明，hUCMSCs將成為自體與同種異基因移植的理想細(xì)胞來源。由于hUCMSCs的生物學(xué)特性、多向分化潛能、不表達(dá)或低表達(dá)免疫排斥相關(guān)的標(biāo)記等特點(diǎn)，使其在臨床再生醫(yī)學(xué)方面的研究應(yīng)用取得了較好的結(jié)果，同時(shí)也被看作細(xì)胞治療的理想靶細(xì)胞。

但是，目前關(guān)于hUCMSCs在治療應(yīng)用方面的研究僅限于臨床試驗(yàn)，對(duì)hUCMSCs在臨床上的應(yīng)用還需要大量的試驗(yàn)及臨床研究，才能從理論和技術(shù)上證實(shí)它對(duì)各種疾病的治療潛能。此外，進(jìn)一步闡明hUCMSCs的生物學(xué)特點(diǎn)，冷凍/溶解技術(shù)以控制其生長和誘導(dǎo)定向分化，對(duì)hUCMSCs長期傳代后有無惡變傾向，惡變的檢測控制以及在擴(kuò)增分化方面達(dá)成共識(shí)，這些對(duì)于hUCMSCs移植治療的應(yīng)用十分重要。

參考文獻(xiàn)

[1] Mitchell K E，Weiss M L，Mitchell B M，et al.Matrix cells from Whartons jelly form neurons and glia[J].Stem Cells，2003，1：50-60.

[2] Yoon J H，Roh EY，Shin S，et al.Introducing pulsed low-intensity ultrasound to culturing human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells[J].Biotechnol Lett，2009，31（3）：329-335.

[3] Huang Peng，Lin Li-Min，Wu Xiao-Ying，et al.Differentiation of human umbilical cord Whartons jelly-derived mesenchymal stem cells into germ-like cells in vitro[J].J Cell Biochem，2010，109（4）：747-754.

[4] Lund R D，Wang Shaomei，Liu Bin，et al.Cells isolated from umbilical cord tissue rescue photoreceptors and visual functions in a rodent model of retinal disease[J].Stem Cells，2007，25（3）：602-611.

[5] 韓明遠(yuǎn)，馮世慶，李輝，等.移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，19：3483 -3489.

[6] 高連如，張寧坤，陳宇，等.臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在心力衰竭細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用[P].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，101690731A，2010-04-07.