鄭博元，王華軍，鄭小飛，陳述祥

腱骨結(jié)合部損傷及愈合問題廣泛存在于全身各關(guān)節(jié)，在膝關(guān)節(jié)交叉韌帶、肩關(guān)節(jié)肩袖以及跟腱止點等重要位置尤顯突出。在美國，肌腱勞損約占運動損傷的30%～50%，每年約有20萬例前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）出現(xiàn)撕裂[1]；而肩袖損傷約占肩關(guān)節(jié)疾病的50%，發(fā)病率隨年齡增長而逐步升高，美國每年用于肩袖手術(shù)及康復的費用高達70億美元。但韌帶重建后長期療效并不樂觀，約有32%的ACL重建患者預后不滿意，10%需要再次手術(shù)，肩袖修復術(shù)后再斷裂率也高達30%～94%[2-3]。牢固的腱骨愈合是保證韌帶重建成功并發(fā)揮功能的關(guān)鍵[4]，而腱骨損傷和愈合的不同階段均受到多種生物因子和信號通路的調(diào)控。進一步明晰生物因子及其信號通路的調(diào)控機制和作用，同時從基因?qū)用嫱ㄟ^非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）調(diào)控生物因子，對改善腱骨愈合質(zhì)量、加快腱骨愈合速度、降低重建術(shù)后的再斷裂率具有重要意義。

1 腱骨愈合過程與生物因子

腱骨連接界面從肌腱過渡到骨通常可分為肌腱（纖維結(jié)締組織）層、非鈣化纖維軟骨層、鈣化纖維軟骨層和骨組織層，這種組織結(jié)構(gòu)有利于載荷傳遞以及應(yīng)力的分散。修復手術(shù)很難恢復原有組織結(jié)構(gòu)的生物學特性，通常只是形成了富含Ⅲ型膠原的瘢痕組織，在載荷傳遞以及拉應(yīng)力分散等方面明顯不足，也因此容易再次受到損傷[5]。術(shù)后腱骨愈合通常經(jīng)歷3個連續(xù)時期[6]：①第1周炎癥期，炎癥細胞吞噬壞死組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等一系列生物因子；②第2周修復期，上述生長因子明顯增多，促進細胞外基質(zhì)合成以及骨細胞、軟骨細胞的增殖分化；③第3周開始進入重塑期，膠原逐漸排列整齊，新形成的骨與肌腱移植物進行重塑，機械強度提高。

1.1 白細胞介素（interleukin，IL）

白細胞介素能夠協(xié)調(diào)白細胞、免疫細胞和紅細胞生長因子，通過傳遞細胞信息影響造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，在腱骨愈合過程中往往起到促炎作用。Haslauer等[7]發(fā)現(xiàn)在腱骨愈合的早期階段，IL-8和IL-6分泌增加并可募集和激活中性粒細胞，進而促進急性炎癥的進展。而炎性細胞因子IL-6和IL-1能夠抑制肌腱衍生祖細胞（tendonderived progenitor cells，inTPC）向肌腱、軟骨和骨骼分化，阻礙細胞外基質(zhì)和蛋白聚糖的分泌，減緩腱骨愈合[8-9]。Lin等[10]通過敲除IL-4或IL-6的小鼠模型，驗證了促炎癥因子IL-6和抗炎癥因子IL-4在肌腱愈合中的相反作用。由于早期炎癥反應(yīng)對腱骨愈合不利，因此在術(shù)后早期，應(yīng)盡可能抑制IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子的作用，同時提高IL-4等抗炎因子的正性效應(yīng)。

1.2 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）

MMPs家族因需要鈣鋅等離子輔助而得名，對彈力蛋白、膠原蛋白等起降解作用，參與組織的發(fā)育、創(chuàng)傷乃至移植的愈合重塑。MMP-1、MMP-2以及金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）在小鼠和兔的腱骨界面表達，提示其參與腱骨修復的重塑過程[11-12]。Pastenak等[11]的組織學和生物力學研究結(jié)果證實，通過阻斷MMPs活性可促進腱骨愈合，正常情況下MMPs對基質(zhì)的分解作用不利于腱骨愈合進程。如欲恢復腱骨結(jié)合的生物及力學特性，必須抑制MMPs的產(chǎn)生，其中一個重要思路是增加內(nèi)源性抑制劑TIMPs數(shù)量，以拮抗其對細胞外基質(zhì)的降解作用。

1.3 生長因子（growth factor，GF）

1.3.1 TGF-βTGF-β是一個調(diào)節(jié)細胞生長和分化的家族，在哺乳動物細胞內(nèi)有β1、β2、β3等 3個亞型。部分亞型在損傷修復過程中可促進成纖維細胞和巨噬細胞聚集以抑制慢性炎癥，具有調(diào)節(jié)自身免疫和抑制移植排斥反應(yīng)的作用。Kovacevic等[13]在岡上肌修復術(shù)中于腱骨表面添加TGF-β3，發(fā)現(xiàn)在促進早期纖維軟骨生長，增加新骨形成、Ⅰ型～Ⅲ型膠原比例以及膠原纖維規(guī)整性等方面，TGF-β3添加組均優(yōu)于對照組。另有研究表明，TGF-β1可誘導干細胞向韌帶細胞或組織分化，具有促進術(shù)后腱-骨愈合的功能[14]。

但也有研究指出，TGF-β1并不能促進腱骨結(jié)合部位形成4層正常生理結(jié)構(gòu)，只是促進了纖維瘢痕組織的增生，當TGF-β1受到抑制時，纖維化、脂肪浸潤和肌肉萎縮等不利情況將顯著減少[15]。有學者從纖維軟骨面積、膠原組織和骨形成等方面來衡量TGF-β3的無瘢痕愈合潛能，結(jié)果表明，磷酸鈣+TGF-β3組的愈合效果反而比磷酸鈣組更差，提示TGF-β3對腱骨愈合過程具有干擾作用[16]。

有關(guān)TGF-β在腱骨愈合中扮演的角色，不同實驗得出完全不同的結(jié)論，其原因可能是實驗?zāi)Ｐ图皩嶒炦^程不同，多種生長因子之間存在尚未明確、難以控制的相互作用和干擾，其機制還需進一步深入研究。

1.3.2胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）IGF與胰島素高度同源，其中IGF-1具有刺激肌腱細胞有絲分裂和基質(zhì)合成的作用，可調(diào)控細胞增殖和機體生長發(fā)育。有研究證實IGF-1可延長肌腱干細胞的多向分化時間，對其增殖和維持表型起到積極的促進作用[17]；IGF-1和TGF-β1聯(lián)合使用還可誘導間充質(zhì)干細胞分化為腱細胞，經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用處理的韌帶結(jié)構(gòu)較單一應(yīng)用具有更強的最大拉伸負荷能力[18]。而一旦敲除IGF基因，受損的肌肉和肌腱就會呈現(xiàn)出不穩(wěn)定的愈合反應(yīng)[19]，這也反向證明IGF-1可促進腱細胞的分化，并提高肌腱的韌性和強度。

1.3.3血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）VEGF能夠促進損傷組織的血管新生，通過激活一氧化氮合酶增加毛細血管的通透性[20]。既往研究證明其在腱骨愈合過程中可促進愈合組織的再血管化，提高愈合韌帶的強度，且不會增加黏連，但內(nèi)源性VEGF生成不足，

需要人工補充外源性VEGF以促進腱骨愈合的血管化[21]。但也有研究得出相反的結(jié)論，認為VEGF

可侵入內(nèi)皮細胞引起ECM蛋白水解，從而影響肌腱的愈合[22]；亦有研究表明，VEGF表達與血管密度增加、脂肪浸潤、肌肉萎縮呈正相關(guān)[23]。目前兩種不同的觀點均有待進一步的實驗證實，同時還需明確VEGF與肌腱血管化之間的量效關(guān)系，以便更好地指導外源性VEGF的應(yīng)用。

1.3.4骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）BMP廣泛存在于骨基質(zhì)中，對骨髓基質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為骨細胞、軟骨細胞起誘導促進作用。BMP有20多種亞型，目前報道較多的

BMP-2、7、12、13、14均對腱骨愈合過程起促進作用。其中BMP-2是誘導成骨活性最強的BMPs之一，可促進干細胞成骨、成軟骨、成脂三向分化，促進血管形成，同時也與肌腱病變中的軟骨組織變性、骨組織變性等有關(guān)。Schwarting等[24]的系列實驗表明，BMP-2和BMP-7均可促進多種目標基因的表達，促使與腱骨愈合相關(guān)的堿性磷酸酶、骨鈣蛋白等多種指標上調(diào)，促進腱骨界面的組織分化，

從而加快腱骨愈合的進程；Kabuto等[25]利用水凝明膠薄膜持續(xù)釋放BMP-7，使SD大鼠肩袖的腱骨界面在組織學及生物力學性能方面均得到增強。

BMP-14亦被稱為軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1）或生長分化因子5（growth differentiation factor 5，GDF-5），既可誘導骨與軟骨形成，又能誘導肌腱和韌帶形成，同時與細胞增殖及血管新生密切相關(guān)。BMP-12（又稱GDF-7）僅能誘導干細胞向肌腱或韌帶樣組織分化，不能誘導骨及軟骨形成。運用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12（rhBMP-12）修復綿羊肩袖損傷，可促進腱骨結(jié)合處形成連續(xù)膠原纖維，使肌腱最大負荷強度顯著提高[26]。Jiang等[27]的研究結(jié)果則表明，與對照組及富血小板血漿組相比，局部注射BMP-13（又稱GDF-6）能促進肌腱愈合，提高抗張力強度，有效降低再撕裂發(fā)生率。

1.3.5 PDGF PDGF是由血小板或平滑肌細胞分泌的堿性多肽因子，由A、B兩種亞基通過二硫鍵結(jié)合成 3種異構(gòu)體——PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB。其能促進腱細胞增殖，促進血管新生及表面信號分子表達，加速肌纖維母細胞產(chǎn)生膠原。PDGF-BB的表達高峰通常出現(xiàn)在腱骨愈合炎癥期和修復期的過渡階段，Tokunaga等[28]的實驗證明，PDGF-BB能使大鼠損傷肩袖重新恢復膠原纖維排列，力學性能大為提高，這與既往關(guān)于羊肩袖損傷的實驗結(jié)論類似[29]。以上研究表明，PDGF在解剖形態(tài)和力學強度等方面均有助于腱-骨愈合。

亦有研究認為PDGF對腱骨愈合并沒有確切的促進和改善作用。Kovacevic等[30]發(fā)現(xiàn)，在大鼠肩袖愈合的早期階段，rhPDGF-BB可促進黏連部位的細胞增殖和血管生成，但晚期對纖維軟骨形成或膠原纖維成熟沒有任何影響；Würger-Hauri等[31]將PDGF應(yīng)用于大鼠肩袖損傷修復，膠原纖維排列與對照組并無明顯差異；Uggen等[32]亦指出，采用PDGF涂層縫線修復羊?qū)录‰鞊p傷并未改善其力學強度?？梢?，對于PDGF的生物學作用還需進一步的實驗予以證明。

1.3.6 bFGF 又稱為FGF-2或FGF-β，由白細胞、肌腱細胞及成纖維細胞等釋放產(chǎn)生，主要促進創(chuàng)傷愈合，在腱骨愈合過程中能刺激血管生成，促進成纖維細胞增殖遷移，加速骨、軟骨和肌腱的修復。bFGF于肩袖損傷后5～9 d達到高峰，在整個修復過程中均表達為高度上調(diào)，有效促進了新血管形成及成纖維細胞增殖[33]。Ide等[34]在大鼠肩袖損傷模型中局部給予bFGF后，明顯增強腱骨止點肌腱的成熟度和極限載荷強度。國內(nèi)外諸多研究均證實，bFGF可刺激腱周血管生成及膠原分泌，促進肌腱愈合，增強肌腱強度，降低肌腱黏連可能[35-36]。

1.4 其他生物因子

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）在骨髓中合成，通過直接激活中性粒細胞影響炎癥過程，因此促進G-CSF的連續(xù)釋放可提高肩袖修復的免疫組織學和生物力學性能[37]。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）參與介導TGF-β1信號通路，是纖維化的共因子[38]，能夠通過修改其他生長因子，促進BMP-12在肩袖損傷修復中的致敏作用[39]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可抑制成骨細胞形成，提高破骨細胞活性，同時參與瘢痕形成過程，對腱骨愈合不利。Gulotta等[40]通過動物實驗阻斷TNF-α，加速了大鼠的腱骨愈合過程。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）則可促進多種細胞的增殖分化，使腱骨愈合在組織學和力學兩個方面強度提高、速度加快[41-42]。

2 信號通路對腱骨愈合的調(diào)控作用

在腱骨愈合過程中，生物因子往往是通過信號通路發(fā)揮生物學作用的。Wang等[43]在兔ACL重建模型中上調(diào)TGF-β的表達水平，進而證實其具有促進ACL愈合的作用，同時發(fā)現(xiàn)TGF-β/MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、c-jun and c-myc也隨之表達增加；隨后研究人員又通過TGF-β抑制實驗，進一步證明了TGF-β/MAPK信號通路在腱骨愈合過程中的調(diào)節(jié)作用。江華基等[44]利用雄性SD大鼠構(gòu)建腱骨愈合模型，研究黃芩素對腱骨愈合的促進作用及其機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩素治療組腱骨愈合強度較對照組顯著升高，同時黃芩素可促進WNT/β-catenin信號通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin、Runx2以及OCN蛋白的表達，因此認為黃芩素通過激活WNT/β-catenin信號通路、促進肌腱干細胞的成骨分化，加速了腱骨愈合的過程。張新濤等[45]在骨碎補總黃酮對大鼠腱骨愈合作用的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮的生物學作用是通過mTOR信號通路實現(xiàn)的，其下游標記蛋白P-S6蛋白表達增加，P-4E/BP1蛋白表達降低，最終促進了成骨相關(guān)蛋白Runx2以及OCN蛋白的表達。亦有研究發(fā)現(xiàn)COX-2/PGE2是腱骨連接中重要的力學信號通路，力學刺激可通過與PI3K/Akt的共同作用，對肌腱細胞凋亡和腱骨愈合過程進行調(diào)控[46]。但目前信號通路的相關(guān)研究較少，關(guān)鍵信號通路的具體調(diào)節(jié)作用仍需進一步明確。

3 腱骨愈合研究的潛在方向——非編碼RNA

隨著基因技術(shù)的發(fā)展，骨與軟骨的代謝機制研究已經(jīng)從蛋白、信號通路水平，逐步深入至分子生物水平。遺傳信息的傳遞可以概括為DNA→RNA→蛋白質(zhì)。其中RNA可以分為編碼RNA（也稱信使RNA，mRNA）和ncRNA兩大類。ncRNA包括長鏈ncRNA（lncRNA）和微小RNA(miRNA）等，因其未翻譯成蛋白質(zhì)，曾一度被視為垃圾RNA，但越來越多的證據(jù)表明，其活躍作用于細胞生物學的各個方面，與生長因子、細胞因子、趨化因子以及炎癥、氧化應(yīng)激和代謝過程密切相關(guān)[47-48]。

腱骨愈合中的一系列病理生理過程，如局部炎癥反應(yīng)，血管新生，成纖維細胞增殖，骨、軟骨和肌腱韌帶組織壞死修復重生等，必然有ncRNA參與其中。Thankam等[49]通過炎癥與JAK2/STAT3信號通路研究miRNA表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)235個miRNAs表達改變。Ahn等[50]應(yīng)用mRNA微陣列分析方法，明確愈合與未愈合肩袖肌腱的遺傳差異，結(jié)果提示炎癥反應(yīng)基因的下調(diào)和細胞分化基因的上調(diào)與肩袖愈合有關(guān)。Chaudhury等[51]同樣采用微陣列技術(shù)，試圖通過分析研究不同類型肩袖撕裂的基因表達譜，進一步了解病理改變與撕裂大小的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肩袖撕裂后可上調(diào)許多關(guān)鍵基因的表達，大、小肩袖撕裂組的基因表達譜與正常對照組差異顯著。

盡管外傷不受基因控制，但軟骨、肌腱以及韌帶的慢性勞損在一定程度上受基因控制，且急慢性損傷的修復均受基因調(diào)控。目前關(guān)于lncRNA在腱骨愈合中作用的研究相對較少，現(xiàn)有證據(jù)表明，lncRNA可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來調(diào)控下游基因的表達[51]，因此這些基因產(chǎn)物未來可能會成為治療失敗的生物標志物或改善肌腱愈合的治療靶點，而針對lncRNA及其相關(guān)機制的進一步研究，很有可能給腱骨愈合難題帶來新的希望。

4 問題及展望

肌腱（韌帶）與骨之間的愈合過程受多種因子及信號通路的調(diào)控，其機制目前尚未明確。多數(shù)生長因子在腱骨愈合過程中具有加速肌腱愈合、改善肌腱力學特性、減少術(shù)后肌腱黏連的重要作用。生長因子過多或缺乏都會產(chǎn)生不利影響；病變進展的不同時期需要的生長因子不同，相同因子在不同病變進展時期，所產(chǎn)生的作用也許完全相反。目前的研究報道大多數(shù)為一種細胞因子單獨應(yīng)用或兩種聯(lián)合使用，但實際的生理過程是受多種因子共同作用的影響。今后的研究方向之一是聯(lián)合應(yīng)用多種生物因子，以發(fā)揮最大優(yōu)勢。上游ncRNA對各種細胞因子的調(diào)控，以及生長因子對下游信號通路的具體調(diào)節(jié)作用亦需要進一步明確。我們相信，隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步，lncRNA從基因?qū)用鎸Ω鞣N細胞因子的調(diào)控，將為腱骨愈合過程中細胞因子的研究及其應(yīng)用打開一扇新的窗戶。