楊夢香 柴方超 周前進① 苗 亮 黃光亮 陳 炯

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 寧德市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 寧德 352100)

河流弧菌為嗜鹽性革蘭性陰性菌, 廣泛分布于河流和近?？谒? 可導(dǎo)致魚蝦貝等多種水生動物患病, 是海水養(yǎng)殖的主要病原菌之一(Baffone et al,2001)。同時, 河流弧菌可從不同水體、城市污水、動物和人類糞便, 以及水產(chǎn)品中分離得到, 感染后導(dǎo)致人出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣腹瀉, 伴隨嘔吐、腹痛、發(fā)燒, 以及不同程度的脫水等癥狀(Chowdhury et al, 2012;Ramamurthy et al, 2014)。在美國, 該細(xì)菌還被認(rèn)為是引起嬰兒小腸結(jié)腸炎的重要病原之一(Bellet et al,1989)。因此, 河流弧菌已成為一種重要的全球性人獸共患病病原菌, 不僅危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 而且對人類健康和食品安全也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅, 因此亟待建立靈敏、快捷、特異的檢測技術(shù)用于基層檢測。

目前, 河流弧菌的檢測以傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定為主, 但是該方法存在檢測周期長、費時費力等缺點, 而且檢測人員需要專業(yè)的知識背景, 遠(yuǎn)不能滿足疾病的快速診斷和及時治療。尤其, 該病原菌被認(rèn)定為人獸共患病病原菌, 使得對于該病原的快速準(zhǔn)確鑒定變得更加重要。因以蛋白或核酸為檢測靶標(biāo)的分子檢測技術(shù)具有檢測快速、高靈敏度等優(yōu)點,在病原微生物的診斷和鑒定等領(lǐng)域得到廣泛使用,但關(guān)于河流弧菌分子檢測技術(shù)的報道還很少?；赑CR原理的核酸擴增技術(shù)均以toxR基因作為檢測靶標(biāo)(Chakraborty et al, 2006; 曹際娟等, 2008; 文萬僥等, 2009; Vinothkumar et al, 2013)。其中, 曹際娟等(2008)將 PCR技術(shù)與高效液相色譜聯(lián)合應(yīng)用于河流弧菌的檢測, 也取得了較好的效果。鄢慶枇等(2006)使用滅活的河流弧菌抗原制備了效價較高的特異性抗血清, 利用該血清建立了河流弧菌的熒光抗體檢測技術(shù)應(yīng)用于牙鲆(Paralichthys olivaceus)體內(nèi)該病原的檢測。已有的這些方法存在著對實驗設(shè)備要求高、工作環(huán)境嚴(yán)格等局限性, 僅限于實驗室診斷, 不能很好地在基層檢測中普及推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)自被報道以來, 憑借其低設(shè)備依賴性、高靈敏度和特異性等優(yōu)勢, 在病原微生物的檢測領(lǐng)域取得了巨大成功(Niemz et al, 2011; Mori et al, 2013)。但該方法在檢測過程的某些階段仍存在很大的提高空間。如何做到在有效、準(zhǔn)確判讀結(jié)果的基礎(chǔ)上, 使得產(chǎn)物的檢測過程也脫離對儀器設(shè)備的依賴, 是 LAMP方法改進性研究的重要方向。LAMP-LFD技術(shù)的原理是將LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物與特異性的探針雜交, 通過熒光素標(biāo)記在橫向流動試紙條(lateral flow dipstick, LFD)上完成顯色和結(jié)果判讀。該方法無需EB等有毒試劑, 也擺脫了對儀器設(shè)備的依賴, 特異性探針可極大程度地降低了產(chǎn)物的假陽性。該項技術(shù)目前已成功用于 ISKNV (Infectious spleen and kidney necrosis virus, 傳染性脾腎壞死病毒) (Ding et al, 2010)、IMNV (Infectious myonecrosis virus, 傳染性肌肉壞死病毒) (Puthawibool et al, 2009),以及海豚鏈球菌(Strepstococcus iniae)等水產(chǎn)病原微生物的檢測(王瑞娜等, 2014)。

作者在本文中根據(jù)河流弧菌外膜蛋白 ompU基因的保守區(qū), 設(shè)計出3對引物和1條異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的探針, 優(yōu)化反應(yīng)條件后, 建立了LAMP-LFD技術(shù), 以期為河流弧菌的現(xiàn)場即時檢測提供一種便捷可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

河流弧菌(Vibrio fluvialis ATCC 33809)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 7966)、哈維氏弧菌(V. harveyi ATCC 33866)和創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus ATCC 27562)購自中國普通微生物菌種保藏中心; 遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda MCCC 235)由中國海洋微生物菌種保藏管理中心惠贈; 溶藻弧菌(V.alginolyticus ATCC 17749)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae ATCC 29178)購自美國菌種保藏中心; 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)和單增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)購自廣東省微生物菌種保藏中心; 鰻弧菌香魚分離株(V.anguillarum ayu-H080701)為本實驗室保存的菌種。其中, 河流弧菌ATCC 33809用于LAMP-LFD的條件優(yōu)化和靈敏度分析實驗。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與基因組DNA制備 將實驗所需的各弧菌從–70°C取出后, 在TCBS固體培養(yǎng)基上劃線接種, 28—30°C培養(yǎng)12—24h后, 挑取單菌落于堿性蛋白胨水中震蕩培養(yǎng)至所需濃度; 海豚鏈球菌、遲緩愛德華菌、嗜水氣單胞菌和單增李斯特菌劃線接種于LB或BHI固體培養(yǎng)基, 于30°C或37°C培養(yǎng)后,挑取單菌落, 于LB或BHI液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至所需濃度。

新鮮培養(yǎng)的各細(xì)菌菌株, 菌落計數(shù)后調(diào)整濃度至1.0×108cfu/mL, 作為起始濃度。分別取所需濃度的各實驗菌株新培養(yǎng)液1mL, 按照基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) D3350-01 (Omega Bio-Tek, USA)提取基因組DNA, 溶解于50 μL的無菌ddH2O用于PCR和LAMP實驗。

1.2.2 引物設(shè)計 選擇已在 NCBI公布的河流弧菌的外膜蛋白ompU (登錄號: KC182592)基因, 序列比對分析后, 在保守的基因區(qū)段設(shè)計3對特異性引物(外引物 VflompU-F3和 VflompU-B3, 內(nèi)引物VflompU-FIP和 VflompU-BIP, 環(huán)引物 VflompU-LF和VflompU-LB)用于LAMP反應(yīng); 同時, 設(shè)計1條探針VflompU-HP, 可與LAMP產(chǎn)物特異性雜交, 并用于LFD檢測, 見表1和圖1。其中探針VflompU-HP的 5′端進行異硫氰酸熒光素標(biāo)記, 內(nèi)引物 VflompUFIP的5′端進行生物素標(biāo)記。以上探針和引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。另外, 將外引物VflompU-B3和VflompU-F3也作為PCR擴增的特異性引物, 擴增預(yù)期片段大小約為278bp。

1.2.3 LAMP的反應(yīng)條件確立 以各供試細(xì)菌的基因組DNA為模板, 參考文獻的方法建立LAMP反應(yīng)體系(Ding et al, 2010), 具體組成如下(25μL): 外引物VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L, 內(nèi)引物VflompU-FIP和 VflompU-BIP各 1.6μmol/L, 環(huán)引物VflompU-LB 和 VflompU-LF各 0.4μmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, Tris-HCl (pH 8.8) 20mmol/L, KCl 10mmol/L, MgSO46.5mmol/L, (NH4)2SO410mmol/L,Triton X-100 0.1%, 8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2μL樣品模版。Bst DNA聚合酶能夠在一定的溫度范圍(60—65°C)保持其最佳活性, 根據(jù)實驗室已有的研究結(jié)果結(jié)合文獻報道, 得出 63°C和65°C在研究中最常使用。本研究將LAMP反應(yīng)的溫度設(shè)定為 63°C, 在此基礎(chǔ)上篩得了 LAMP引物。在上述LAMP體系中添加EvaGreen、SYTO 9等熒光染料后, 通過類似于熒光定量 PCR反應(yīng)的方式進行LAMP結(jié)果的判斷(定義為實時熒光LAMP反應(yīng)), 即反應(yīng)的實時曲線特征, 熒光強度等能夠直觀的顯示LAMP反應(yīng)的情況。研究證實, LAMP反應(yīng)陽性擴增的起始時間與模板的添加量具有明顯的相關(guān)性(Zhouet al, 2014)。為確定本研究的LAMP反應(yīng)時間, 我們首先將起始濃度1.0×108CFU/mL以10倍濃度梯度進行稀釋, 將所獲各不同濃度的菌液按步驟 1.2.1的方法提取基因組 DNA, 以此為模板, 進行實時熒光LAMP反應(yīng), 反應(yīng)時間為60min。根據(jù)LAMP反應(yīng)陽性擴增的起始時間結(jié)合熒光曲線到達平臺期的時間,初步分析模板濃度對于 LMAP反應(yīng)的影響。在此基礎(chǔ)上, 選擇較低濃度的細(xì)菌基因組 DNA為模板, 將接近于該濃度下獲得的陽性擴增起始時間作為最短反應(yīng)時間, 以5min作為時間間隔逐步延長反應(yīng)時間,進行多次 LAMP反應(yīng), 確定 LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間。反應(yīng)產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳、LFD,以及在反應(yīng)產(chǎn)物中添加SYBR Green I熒光染料等方法進行結(jié)果判斷。

表1 根據(jù)河流弧菌ompU基因序列設(shè)計的LAMP-LFD擴增引物的序列和DNA探針Tab.1 The primers and DNA probes targeting ompU gene of V. fluvialis used in LAMP-LFD assay

圖1 河流弧菌外膜蛋白ompU基因的LAMP-LFD引物序列及DNA探針設(shè)計Fig.1 The primers and DNA probes targeting ompU gene of V.fluvialis used in LAMP-LFD assay

1.2.4 利用橫向流動試紙條LFD檢測 使用生物素標(biāo)記的內(nèi)引物VflompU-FIP進行LAMP反應(yīng), 反應(yīng)結(jié)束后不經(jīng)過高溫終止反應(yīng), 而是直接向反應(yīng)體系中加入20pmol FITC標(biāo)記的探針VflompU-HP, 63°C雜交 5min; 取雜交液 5μL加入到 100μL LFD buffer(Milenia Biotec GmbH公司, 德國)中混勻; 將LFD試紙條(Milenia Biotec GmbH公司, 德國)的檢測端豎直浸入雜交液中, 靜置3—5min, 以肉眼判別結(jié)果。

1.2.5 河流弧菌的LAMP-LFD特異性實驗 為評價河流弧菌 LAMP-LFD方法的特異性, 選取與之相近的弧菌屬的多個致病菌, 即哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌以及溶藻弧菌, 同時選擇海豚鏈球菌、遲緩愛德華菌、銅綠假單胞菌, 單增李斯特菌以及嗜水氣單胞菌等四種水產(chǎn)養(yǎng)殖或水產(chǎn)品中的常見病原菌。將各菌株的新培養(yǎng)物調(diào)整濃度至 1×105CFU/mL, 按1.2.1所述, 提取基因組 DNA, 并以此為模板, 利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng),待產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng) LFD 進行結(jié)果判讀; 同時LAMP產(chǎn)物也通過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及添加SYBR Green I的方法進行判讀。

1.2.6 河流弧菌LAMP-LFD的靈敏度實驗 取培養(yǎng)的新鮮河流弧菌菌液, 調(diào)整至起始濃度 1.0×108CFU/mL, 進行 10倍濃度梯度稀釋, 按照步驟 1.2.1提取基因組DNA, 各濃度制備三個平行樣品。利用優(yōu)化反應(yīng)條件, 進行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng), 產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng) LFD進行結(jié)果判讀; 同時 LAMP產(chǎn)物也通過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及添加 SYBR Green I的方法進行判讀。

同時, 我們選擇由 VflompU-F3VflompU-B3為引物的 PCR方法作為方法學(xué)上的比較。選擇上述各稀釋度的基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系(25μL)包括: 10×PCR buffer 2.5μL, rTaq DNA 聚合酶 (5U/μL) (TaKaRa, 大 連 ) 0.15μL, dNTPs(2.5mmol/μL) 2μL, VflompU-F3 (10pmol/μL) 1μL,VflompU-B3 (10pmol/μL) 1μL, 基因組 DNA 模板2μL。PCR 的反應(yīng)程序為: 94°C 預(yù)變性 1 min; 94°C 變性30s, 54°C退火30s, 72°C延伸30s, 30個循環(huán); 最后在72°C延伸10min。對反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.7 LAMP-LFD重復(fù)性實驗 取1mL培養(yǎng)的新鮮河流弧菌菌液, 計數(shù), 調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL,以此為起始濃度, 進行 10倍濃度梯度稀釋, 按照步驟1.2.1提取基因組DNA, 每個濃度制備三個平行樣品。以此 DNA為模板, 利用優(yōu)化反應(yīng)條件, 進行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng), 產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng)LFD進行結(jié)果判讀, 驗證方法的可重復(fù)性; 同時,LAMP產(chǎn)物也利用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和 SYBR Green I染料判讀結(jié)果, 并與LFD結(jié)果進行比較分析。

1.2.8 河流弧菌人工污染大黃魚組織實驗 取若干份健康大黃魚的肝臟組織100mg加入少量無菌水,充分勻漿后, 定容至 1mL。取 1mL新鮮培養(yǎng)的河流弧菌菌液(約 1.0×108CFU/mL)進行 10倍濃度梯度稀釋, 分別取濃度為 1.0×101, 1.0×102, 1.0×103, 1.0×104,1.0×105CFU/mL的菌液各1mL, 與大黃魚肝組織勻漿液等體積混勻。每個濃度平行制備三個樣品。取1mL被細(xì)菌污染的肌肉組織樣品, 采用動物組織基因組DNA 提取試劑盒(TaKaRa, 大連)提取該樣品基因組DNA, 溶解于50μL的ddH2O中, 用作PCR和LAMP測試的模板。以健康大黃魚的肝臟組織勻漿液作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴增條件的確定

將起始濃度1.0×108CFU/mL進行倍比稀釋后, 選擇 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102和1.0×101CFU/mL 7個濃度梯度的基因組DNA為模板, 進行實時熒光 LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明, 當(dāng)以1.0×107, 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103和 1.0×102CFU/mL的基因組DNA為模板時, 熒光曲線呈典型的“S”型, 擴增為陽性; 而當(dāng)模板濃度降低至 1.0×101CFU/mL時, 擴增結(jié)果呈陰性(圖2a)。當(dāng)陽性擴增模板濃度由1.0×107逐步降低至1.0×102CFU/mL時, 起峰時間逐漸增加, 呈線性相關(guān)(圖2b)。然后, 選擇可引起陽性擴增的較低模板濃度1.0×102CFU/mL為模板, 設(shè)定多個反應(yīng)時間, 進行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng)。反應(yīng)時間以20min (20min略低于該濃度下的陽性擴增起峰時間)起, 時間間隔為5min, 判斷低濃度下LAMP反應(yīng)的最佳有效時間。各 LAMP產(chǎn)物與探針VflompU-HP雜交后, 經(jīng)LFD試紙條顯色; 同時, 利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和產(chǎn)物中添加 SYBR Green I的方法進行檢測, 比較分析。結(jié)果表明, 當(dāng)反應(yīng)時間為20min時, LFD的檢測線位置未見有條帶, 結(jié)果為陰性; 當(dāng)反應(yīng)時間增至25min時, LFD檢測線位置可見明顯的條帶, 結(jié)果為陰性; 當(dāng)繼續(xù)增加反應(yīng)時間至 30、35和40min時, 利用LFD均可穩(wěn)定地檢測為陽性(圖2d)。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測表明, 當(dāng)反應(yīng)時間為 25min時, 開始明顯檢測到典型的梯形條帶, 反應(yīng)時間為 30min時, 梯形條帶達到最為明亮, 產(chǎn)物量達到最大, 反應(yīng)時間繼續(xù)增加至 40min時, 產(chǎn)物量未見明顯增加(圖2c); 向產(chǎn)物中添加SYBR Green I后觀察發(fā)現(xiàn), 當(dāng)反應(yīng)時間從 25min逐漸增至 40min時, 均可明顯觀察到LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色變化, 反應(yīng)時間為20min時, LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)SYBR Green I稀釋后的橙色, 結(jié)果呈陰性(圖2e)。綜上, 盡管通過瓊脂糖凝膠電泳的方法, 直到反應(yīng)時間達到 30min時才達到帶型最亮, 但是利用LFD和添加SYBR Green I的方法, 在反應(yīng)時間達到25min時即可穩(wěn)定可靠的判定結(jié)果, 因此,應(yīng)用于LFD檢測的LAMP的最佳反應(yīng)時間為25min。

2.2 河流弧菌LAMP-LFD的特異性分析

圖2 LAMP反應(yīng)最適反應(yīng)時間的確定Fig.2 Time optimization of LAMP assay for detection of V. fluvialis

選擇與河流弧菌相似的創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌等弧菌屬的病原菌, 以及海豚鏈球菌、遲緩愛德華菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、嗜水氣單胞菌等常見的水產(chǎn)病原菌的基因組DNA為模板, 63°C條件下進行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng),反應(yīng)時間為25min, 產(chǎn)物與探針雜交后, 用于LFD檢測, 分析 LAMP-LFD方法的特異性。結(jié)果表明以1×105CFU/mL河流弧菌基因組 DNA為模板時,LAMP產(chǎn)物與探針雜交后, 經(jīng)LFD檢測, 檢測線上有明顯條帶, 結(jié)果呈陽性, 瓊脂糖凝膠電泳以及添加SYBR Green I的方法也是顯示陽性結(jié)果。當(dāng)以上述 5種弧菌和其他4種水產(chǎn)病原菌的基因組DNA為模板時, LFD的檢測線位置未見有明顯的條帶, 結(jié)果呈陰性; 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和添加 SYBR Green I檢測,結(jié)果也是陰性。以上說明本研究公布的河流弧菌LAMP-LFD方法具有良好的特異性。

2.3 河流弧菌LAMP-LFD的靈敏度驗證

根據(jù) LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化時獲得的實時熒光LAMP數(shù)據(jù), 以起始濃度1.0×108CFU/mL作為最高濃度, 1.0×101CFU/mL作為最低濃度, 在上述優(yōu)化反應(yīng)條件下, 進行有生物素標(biāo)記的LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示, 當(dāng)模板濃度從 1.0×108CFU/mL逐漸降低至1.0×102CFU/mL時, 利用LFD方法均可穩(wěn)定檢測到陽性結(jié)果; 當(dāng)使用 1.0×101CFU/mL的菌液作為模板時, 檢測結(jié)果呈陰性。這表明經(jīng)LFD檢測的最低模板濃度為1.0×102CFU/mL或4 CFU/反應(yīng)(圖4b)。同時,LAMP產(chǎn)物經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和添加 SYBR Green I的方法檢測發(fā)現(xiàn), 能夠檢測到的最低模板濃度同樣是 1.0×102CFU/mL (圖 4a, 4d)。而以VflompU-F3VflompU-B3為引物的PCR方法可以檢測到1.0×103CFU/mL或者40CFU/反應(yīng)的最低模板濃度(圖 4c)。

圖3 LAMP (a, c)和LAMP-LFD (b)的特異性實驗結(jié)果Fig.3 Specificity test of LAMP (a, c) and LAMP-LFD (b) for detection of V. fluvialis

2.4 河流弧菌 LAMP-LFD重復(fù)性分析

為分析河流弧菌 LAMP-LFD方法的重復(fù)性, 同時評價依托于恒溫水浴鍋等普通儀器的 LAMP-LFD的穩(wěn)定性, 重新取河流弧菌的新鮮培養(yǎng)液, 進行倍比稀釋后, 將濃度調(diào)至1.0×102CFU/mL后, 提取基因組DNA, 進行有生物素標(biāo)記的 LAMP反應(yīng), 反應(yīng)條件為 63°C 溫育 25min。結(jié)果表明, 以最低檢測濃度1.0×102CFU/mL的河流弧菌基因組DNA為模板獲得的LAMP產(chǎn)物, 經(jīng)LFD試紙條、瓊脂糖凝膠電泳, 以及添加SYBR Green I的方法均能穩(wěn)定獲得陽性結(jié)果;以蒸餾水為模板時, 檢測結(jié)果呈陰性, 說明依托于簡單儀器的LAMP-LFD具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 采用 LAMP-LFD方法檢測哈維氏弧菌污染大黃魚組織的靈敏度和適用性分析

將不同濃度河流弧菌對大黃魚的組織進行等體積污染后, 提取混合勻漿液的基因組 DNA, 經(jīng)LAMP-LFD和 PCR分別檢測, 結(jié)果顯示當(dāng)污染組織的菌液濃度達到 1.0×103CFU/mL時, 利用 LAMPLFD即可從污染的肝臟組織中穩(wěn)定檢測到病原, 靈敏度為5×102CFU/mL或20 CFU/反應(yīng)(表2); 當(dāng)污染組織的菌液濃度達到1.0×104CFU/mL時, 利用PCR方法即可從污染的肝臟組織中穩(wěn)定地檢測出病原,達到 5×103CFU/mL或 200CFU/反應(yīng)的靈敏度, 結(jié)果見表2。

3 討論

圖4 檢測河流弧菌的不同方法靈敏度比較Fig.4 Comparison in detection limit to V. fluvialis by different motheds

表2 利用河流弧菌人工污染大黃魚組織樣品后本研究的LAMP-LFD檢測和PCR檢測結(jié)果Tab.2 Detection of V. fluvialis from artificial-contaminated tissue samples of Pseudosciaena crocea by both LAMP-LFD and PCR assays

圖5 LAMP (a, c)和LAMP-LFD (b)的重復(fù)性試驗Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD (a, c) and LAMP (b) of detection for V. fluvialis

河流弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種重要病原菌, 隨著海鮮產(chǎn)品在飲食結(jié)構(gòu)比重中的逐漸增加, 由河流弧菌引發(fā)的人體疾病也越來越受到重視(Chowdhuryet al, 2012; Ramamurthyet al, 2014)。在我國, 河流弧菌已在牙鲆、石斑魚、大黃魚等主要養(yǎng)殖動物中檢出(鄢慶枇等, 2006; 王曉露等, 2008; 朱蘇琴等, 2012),成為嚴(yán)重威脅人體健康的潛在因素之一(周妍妍等,2016)。因此, 如何實現(xiàn)該病原的快速診斷和準(zhǔn)確鑒定,切斷該病原在養(yǎng)殖、流通, 以及餐桌等環(huán)節(jié)的傳播,對于維護公共衛(wèi)生健康具有重要意義?；诖? 本研究選擇河流弧菌的外膜蛋白ompU基因作為檢測靶標(biāo),建立了便捷易操作的 LAMP-LFD技術(shù), 特異性地應(yīng)用于組織樣品中河流弧菌的檢測。

自 LAMP技術(shù)問世以來, 憑借其檢測的高靈敏度、高便捷性、低設(shè)備依賴性等優(yōu)點, 在微生物檢測領(lǐng)域取得了巨大應(yīng)用。本研究公布的LAMP-LFD技術(shù), 保留了LAMP方法自有特點的基礎(chǔ)上, 在檢測便捷性、設(shè)備低依賴性等方面有了進一步提高。LAMP技術(shù)涉及的關(guān)鍵因素Bst DNA聚合酶可在單一溫度下實現(xiàn)核酸的幾何級數(shù)增長, 極大地降低了反應(yīng)過程儀器設(shè)備的復(fù)雜度, 使得諸如恒溫金屬浴等簡單設(shè)備都可成為反應(yīng)容器, 大幅度降低儀器成本的同時, 也增加了操作的便捷性。而在LAMP產(chǎn)物的檢測方面, 通常借助于凝膠成像系統(tǒng)、濁度儀, 以及熒光定量PCR儀等完成, 在儀器成本、操作便捷性方面有諸多限制; 通過添加SYBR Green I等核酸染料的方式雖然便捷, 但假陽性較高(Borstet al, 2004)。本研究將LFD試紙條引入到LAMP產(chǎn)物的檢測過程, 產(chǎn)物經(jīng)約5min的探針雜交和3—5min的LFD顯色, 即可判讀結(jié)果, 此過程中僅需一把移液器即可完成操作, 摒棄了對于昂貴儀器的依賴, 整個產(chǎn)物檢測在10min內(nèi)即可完成, 大幅度提高了檢測的便捷性和流動性, 尤其適用于基層或現(xiàn)場疫源地的快速檢測。針對河流弧菌分子生物學(xué)檢測的方法多數(shù)基于 PCR的的反應(yīng)原理, 從核酸擴增到利用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行判讀, 根據(jù)檢測靶標(biāo)的片段大小, 檢測時程約在3h左右, 甚至更長(Chakrabortyet al, 2006;文萬僥等, 2009; Vinothkumaret al, 2013); 鄢慶枇等(2006)建立的熒光抗體技術(shù)檢測牙鲆體內(nèi)河流弧菌的感染時, 整個耗時也需 3h左右; 而本研究提供的LAMP-LFD技術(shù), LAMP反應(yīng) 25min, 所得產(chǎn)物經(jīng)10min左右的 LFD顯色過程, 整個檢測時程約需35min, 耗時更短。

靈敏度是衡量核酸檢測類方法的重要技術(shù)指標(biāo)。文萬僥等(2009)將河流弧菌的 toxR基因作為檢測靶標(biāo), 建立了可特異性檢測河流弧菌的PCR方法, 可從低至 9.3×103CFU/mL的菌液樣品中檢測到病原;Vinothkumar等(2013)針對河流弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等3種弧菌屬致病菌建立了多重PCR技術(shù),針對單一菌種的靈敏度為10個CFU; 鄢慶枇等(2006)公布的熒光抗體技術(shù)能夠從注射河流弧菌(107CFU)24h后的牙鲆臟器中檢測到該病原。本研究使用的河流弧菌LAMP-LFD技術(shù)能夠從1.0×102CFU/mL的細(xì)菌菌液或5×102CFU/mL感染強度的組織樣品中穩(wěn)定檢測到病原, 體現(xiàn)出良好的方法靈敏度。

4 結(jié)論

作者在本文中以河流弧菌外膜蛋白的 ompU基因為檢測靶標(biāo)建立了 LAMP-LFD方法, 可特異性地應(yīng)用于河流弧菌的檢測, 并對創(chuàng)傷弧菌等常見的水產(chǎn)病原菌沒有交叉反應(yīng)。該方法檢測用時較短, 核酸擴增僅需25min, 加之探針雜交和LFD顯色, 整個時程僅需 35min。該方法仍具有較高的檢測靈敏度, 可達 1.0×102CFU/mL或者 4CFU/反應(yīng)。同時, 該方法從核酸擴增到結(jié)果展示的整個檢測過程對儀器要求極其簡單, 在河流弧菌的基層檢測和現(xiàn)場快檢等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。

王曉露, 鄒文政, 鄢慶枇等, 2008. 病原性河流弧菌對青石斑魚體表黏液黏附特性的研究. 水產(chǎn)學(xué)報, 32(3): 441—447

王瑞娜, 周前進, 陳 炯, 2014. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條可視化檢測海豚鏈球菌方法的建立. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 22(12): 1584—1594

文萬僥, 謝珍玉, 徐先棟等, 2009. 基于toxR基因的河流弧菌PCR快速檢測方法的建立. 水產(chǎn)科學(xué), 28(10): 575—578

朱蘇琴, 紀(jì)榮興, 蘇永全等, 2012. 河流弧菌(Vibrio fluvialis)對大黃魚(Pseudosciaena crocea)鰓黏液黏附特性研究. 海洋與湖沼, 43(2): 389—393

周妍妍, 閆東輝, 蘇建榮, 2016. 臨床分離河流弧菌毒力及藥敏表型特征分析. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 15(5): 492—495

曹際娟, 趙 昕, 孫哲平等, 2008. PCR結(jié)合變性高效液相色譜快速檢測水產(chǎn)品中河流弧菌. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,18(11): 2187—2189

鄢慶枇, 鄒文政, 紀(jì)榮興等, 2006. 應(yīng)用熒光抗體技術(shù)檢測牙鲆體內(nèi)的河流弧菌. 海洋科學(xué), 30(4): 16—19

Baffone W, Citterio B, Vittoria E et al, 2001. Determination of several potential virulence factors in Vibrio spp. isolated from sea water. Food Microbiology, 18(5): 479—488

Bellet J, Klein B, Altieri M et al, 1989. Vibrio fluvialis, an unusual pediatric enteric pathogen. Pediatric Emergency Care, 5(1): 27—28

Borst A, Box A T A, Fluit A C, 2004. False-positive results and contamination in nucleic acid amplification assays:suggestions for a prevent and destroy strategy. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,23(4): 289—299

Chakraborty R, Sinha S, Mukhopadhyay A K et al, 2006.Species-specific identification of Vibrio fluvialis by PCR targeted to the conserved transcriptional activation and variable membrane tether regions of the toxR gene. Journal of Medical Microbiology, 55(6): 805—808

Chowdhury G, Pazhani G P, Dutta D et al, 2012. Vibrio fluvialis in patients with diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases, 18(11): 1868—1871

Ding W C, Chen J, Shi Y H et al, 2010. Rapid and sensitive detection of infectious spleen and kidney necrosis virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. Archives of Virology, 155(3):385—389

Mori Y, Kanda H, Notomi T, 2013. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): recent progress in research and development. Journal of Infection and Chemotherapy, 19(3):404—411

Niemz A, Ferguson T M, Boyle D S, 2011. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends in Biotechnology,29(5): 240—250

Puthawibool T, Senapin S, Kiatpathomchai W et al, 2009.Detection of shrimp infectious myonecrosis virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. Journal of Virological Methods, 156(1—2): 27—31

Ramamurthy T, Chowdhury G, Pazhani G P et al, 2014. Vibrio fluvialis: an emerging human pathogen. Frontiers in Microbiology, 5: 91

Vinothkumar K, Bhardwaj A K, Ramamurthy T et al, 2013.Triplex PCR assay for the rapid identification of 3 major Vibrio species, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,and Vibrio fluvialis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 76(4): 526—528

Zhou Q J, Wang L, Chen J et al, 2014. Development and evaluation of a real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a microfluidic disc chip (on-chip LAMP) for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacteria in aquatic animals.Journal of Microbiological Methods, 104: 26—35