王 雪，姜忠玲，王 新，姜愛民，叢 霞，曹榮峰，李華濤，田文儒

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

隨著全球氣候變暖，特別是在炎熱夏季，髙溫使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基和ROS，嚴(yán)重影響動(dòng)物(包括冷血?jiǎng)游?生存[1]。在哺乳動(dòng)物各種生理功能中，生殖功能最易受熱應(yīng)激損傷[2]。當(dāng)恒溫動(dòng)物生存環(huán)境溫度超出適宜溫度的上限，就會(huì)受熱應(yīng)激影響[3]，從而影響胚胎的生存[4]。輸卵管是早期胚胎發(fā)育的重要場(chǎng)所，而早期胚胎對(duì)氧化應(yīng)激損傷比較敏感[5]。還有研究表明，輸卵管液與卵裂有密切關(guān)系，受精卵在培養(yǎng)液中的發(fā)育要比在輸卵管內(nèi)發(fā)育遲緩，并且出現(xiàn)早胚發(fā)育阻滯[6]。因此，輸卵管組織及其腔內(nèi)環(huán)境對(duì)早期胚胎健康發(fā)育起重要的作用。

黃芩苷分子式為 C21H18O11，是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，如解熱、抗凋亡、抗氧化作用[7-8]，還可抑制黃嘌呤氧化酶活性，清除自由基、超氧陰離子等，對(duì)多種因素引起的細(xì)胞損傷都有一定的保護(hù)作用。然而，目前還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)黃芩苷對(duì)熱應(yīng)激時(shí)輸卵管組織細(xì)胞保護(hù)作用的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)根據(jù)黃芩苷的藥理作用，以熱應(yīng)激小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察熱應(yīng)激條件下黃芩苷是否可以減少輸卵管組織細(xì)胞氧化損傷，并探究其潛在的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 將性成熟、體重在 25～35 g(6～7 周齡)的雌性昆明小白鼠飼養(yǎng)在恒溫(22 ℃)、控光(12 h光/12 h黑)的普通級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝取食物和水。

1.1.2 藥物與試劑 黃芩苷購(gòu)自中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；GOT、SOD、MDA、CAT和GSH-Px生化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成公司；Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1抗體及β-actin均購(gòu)自美國(guó) Proteintech Group 公司；Apaf-1和Caspase-9抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 試驗(yàn)前將小鼠分組為對(duì)照(Ⅰ)組、Bai(Ⅱ)組、熱應(yīng)激(Ⅲ)組和熱應(yīng)激加Bai(Ⅳ)組。Ⅰ組和Ⅱ組小鼠腹腔注射生理鹽水，Ⅲ組和Ⅳ組小鼠腹腔注射黃芩苷(50 mg/kg)，連續(xù)注射7 d，第8天熱應(yīng)激(41 ℃)2 h。

1.2.2 黃芩苷最佳濃度篩選 將小鼠分為對(duì)照組、熱應(yīng)激組、黃芩苷組(25，50，100，150 mg/kg)，對(duì)照組與熱應(yīng)激組腹腔注射生理鹽水，黃芩苷組分別注射不同濃度藥物，連續(xù)注射7 d，第8 天對(duì)熱應(yīng)激組和黃芩苷組進(jìn)行熱應(yīng)激(41 ℃)2 h。最后對(duì)各組小鼠眼球采血后離心取血清，通過谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)試劑盒，測(cè)定血清中GOT含量。

1.2.3 輸卵管組織學(xué)檢查 將中性甲醛固定的輸卵管組織進(jìn)行梯度酒精脫水，二甲苯處理后做石蠟包埋切片，切片后用HE染色，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.2.4 輸卵管組織中氧化標(biāo)志物測(cè)定 用試劑盒檢測(cè)輸卵管中MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量或活性。將輸卵管組織在-80 ℃預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨，并按m∶V=1∶19加入生理鹽水混勻，用普通離心機(jī)以3 000 r/min離心10～15 min，取上清裝入EP 管中標(biāo)記待用，按照相應(yīng)試劑盒操作說明分別檢測(cè) MDA 含量及 SOD、GSH-Px 和 CAT 活性。

1.2.5 Nrf2/Keap1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè) 用 Western Blot 檢測(cè)Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1蛋白表達(dá) ，將在-80 ℃冰箱保存的輸卵管組織取出置于液氮內(nèi)暫時(shí)保存，于研缽內(nèi)研至粉末狀后加入組織裂解液，用普通離心機(jī)以14 000 r/min離心5 min，取上清提取總蛋白，用Western Blot法[9]檢測(cè)。

1.2.6 凋亡相關(guān)因子的檢測(cè) 首先將石蠟包埋的輸卵管組織切片，用二甲苯脫蠟，再用SABC法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，其步驟按SABC試劑盒操作說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。對(duì)于染色后的切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，均數(shù)間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Image J軟件掃描蛋白灰度值，GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，ANOVA法進(jìn)行組間差異性比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩苷濃度對(duì)血清GOT酶的影響

如表1所示，熱應(yīng)激引起小鼠血清GOT活力升高并差異極顯著(P<0.01)；添加不同濃度的黃芩苷均能降低血清GOT活力，與熱應(yīng)激相比差異極顯著(P<0.01)；隨黃芩苷濃度增加，血清GOT活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，黃芩苷濃度高于50 mg/kg時(shí)，血清GOT活力變化不明顯，差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同濃度黃芩苷對(duì)熱應(yīng)激小鼠血清GOT的影響Tab.1 Effects of different concentrations of baicalin on serum GOT in heat stressed mice U/L

注：同列數(shù)據(jù)不同大寫字母表示差異極顯著 (P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different capital letters show significant differences(P<0.01)；and different lowercase letters have significant differences(P<0.05).

2.2 輸卵管組織病理學(xué)變化

對(duì)照組和黃芩苷組小鼠輸卵管組織的上皮單層柱狀細(xì)胞排列規(guī)則，纖毛正常(圖1，Ⅰ組和Ⅱ組)。熱應(yīng)激組細(xì)胞空泡化明顯(圖1，Ⅲ組a)，細(xì)胞體積變小(圖1，Ⅲ組b)，組織間隙增大(圖1，Ⅲ組c)，核濃染，上皮單層柱狀細(xì)胞排列不規(guī)則，絨毛脫落(圖1，Ⅲ組d)。熱應(yīng)激加黃芩苷組有較大改善，空泡化減少(圖1，Ⅳ組a)，纖毛脫落減少(圖1，Ⅳ組b)。

Ⅰ組.對(duì)照組；Ⅱ組.Bai組；Ⅲ組.熱應(yīng)激組；Ⅳ組.熱應(yīng)激加Bai組。Ⅰ.Control group；Ⅱ.Baicalin group；Ⅲ.Heat group；Ⅳ.Heat+Baicalin group.

2.3 組織中氧化指標(biāo)的變化

試劑盒檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組小鼠輸卵管組織中MDA含量顯著(P<0.05)升高，CAT(P<0.01)和GSH-Px(P<0.05)活力顯著降低，此外，SOD活力也有所降低(P>0.05)；與熱應(yīng)激組相比，熱應(yīng)激加黃芩苷組MDA含量顯著(P<0.05)降低，而CAT、GSH-Px和SOD活力則顯著(P<0.05)升高。

2.4 Nrf2和Keap1的表達(dá)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組Nrf2與Keap1表達(dá)量都顯著(P<0.05)升高；而與熱應(yīng)激組相比，熱應(yīng)激加黃芩苷組Nrf2與Keap1表達(dá)量均顯著(P<0.05)降低。

2.5 Ⅱ相解毒酶的表達(dá)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組HO-1表達(dá)量顯著(P<0.05)升高，NQO1表達(dá)量有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；與熱應(yīng)激組相比，熱應(yīng)激加黃芩苷組HO-1和NQO1表達(dá)量降低，差異也不顯著(P>0.05)。

2.6 Apaf-1和Caspase-9蛋白表達(dá)

如圖5，6所示，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，Apaf-1(圖5)和Caspase-9(圖6)主要在輸卵管內(nèi)膜上皮細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色(圖5，6箭頭所指)。黃芩苷組有Apaf-1和Caspase-9蛋白染色，但表達(dá)稀疏且染色較淺(圖5，6，Ⅱ組箭頭所指)。小鼠受熱應(yīng)激后，輸卵管內(nèi)膜上皮細(xì)胞Apaf-1和Caspase-9表達(dá)明顯增強(qiáng)，分布集中且染色較深(圖5，6，Ⅲ組箭頭所指)。而注射黃芩苷后，Apaf-1和Caspase-9表達(dá)明顯低于單獨(dú)熱應(yīng)激組，染色較淺且分布稀疏(圖5，6，Ⅳ組箭頭所指)。

*.與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；**.與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；#.與熱應(yīng)激組相比差異顯著P<0.05；##.與熱應(yīng)激組相比差異極顯著(P<0.01)。圖3-4同。*.Significant difference(P<0.05) compared with the control group；**.Very significant difference(P<0.01)compared with the control group；#.Significant difference(P<0.05) compared with the heat stress group；##.Very significant difference(P<0.01)compared with the heat stress group.The same as Fig.3-4.

圖3 四組小鼠輸卵管組織中Nrf2和Keap1表達(dá)量Fig.3 Expressions of Nrf2 and Keap1 in the oviduct tissue of the four group of mouse

圖4 四組小鼠輸卵管組織HO-1和NQO1表達(dá)量Fig.4 Expressions of HO-1 and NQO1 in the oviduct tissue of the four group of mouse

圖5 四組小鼠輸卵管組織 Apaf-1 蛋白表達(dá)(×100)Fig.5 Expressions of Apaf-1 protein in the oviduct tissue of the four group of mouse

圖6 四組小鼠輸卵管組織 Caspase-9 蛋白表達(dá)(×100)Fig.6 Expressions of Caspase-9 protein in the oviduct tissue of the four group of mouse

3 討論

熱應(yīng)激能引起血清中GOT的活力迅速升高[10]，因此，可通過血清GOT活力評(píng)價(jià)黃芩苷對(duì)小鼠熱應(yīng)激的保護(hù)作用，對(duì)黃芩苷藥物做初步篩選。試驗(yàn)中，當(dāng)黃芩苷濃度高于50 mg/kg時(shí)，血清GOT活力變化不明顯，藥效不顯著，因此，本研究選擇50 mg/kg的藥物劑量。熱應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞能量分解大于合成，從而為ROS大量生成提供條件。當(dāng)氧化程度超出氧化物清除能力時(shí)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)失衡，從而增加組織細(xì)胞損傷和凋亡[3]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，由 ROS 攻擊細(xì)胞生物膜上的多不飽和脂肪酸并使其破壞而形成。MDA的顯著性升高提示機(jī)體氧平衡失調(diào)[11]。SOD、CAT和GSH-Px對(duì)機(jī)體多余的ROS有清除作用[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后小鼠輸卵管組織發(fā)生損傷，其中包括氧化損傷，具體反應(yīng)在組織中MDA含量升高的同時(shí)，抗氧化酶活力降低，組織結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞凋亡增加。

熱應(yīng)激可作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，激活多條信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)[13]。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路Keap1-Nrf2/ARE能抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]，被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路。本試驗(yàn)中，熱應(yīng)激時(shí)輸卵管組織中Nrf2和Keap1表達(dá)升高，并且Nrf2介導(dǎo)了抗氧化酶(SOD、GSH-Px和CAT)和Ⅱ相解毒酶(HO-1和NQO1)表達(dá)，說明熱應(yīng)激激活了Keap1-Nrf2/ARE通路。Nrf2是氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)的感受器，參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和防御外源性有毒物質(zhì)[15]。在正常生理?xiàng)l件下，通過Keap1與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合，被錨定在胞漿內(nèi)，并通過蛋白酶體依賴性途徑和泛素化途徑被降解，半衰期約10～40 min[16]。而在氧化狀態(tài)下，親電子物質(zhì)與 Keap1的半胱氨酸殘基反應(yīng)，導(dǎo)致Keap1與Nrf2解離[17]，Nrf2轉(zhuǎn)位到核內(nèi)介導(dǎo)Ⅱ相解毒酶以及抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，起到保護(hù)細(xì)胞和組織的作用[18]。因此，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為，熱應(yīng)激激活了輸卵管組織Keap1-Nrf2/ARE抗氧化通路，介導(dǎo)了抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，從而對(duì)組織起到一定的保護(hù)作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷增強(qiáng)了抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶表達(dá)，降低輸卵管組織氧化損傷，并且降低了Apaf-1和Caspase-9表達(dá)，在一定程度上抑制了細(xì)胞凋亡。前人研究也發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可誘導(dǎo)Nrf2入核[19]，從而發(fā)揮抗凋亡和抗氧化的作用[7-8]。隨著組織氧化還原平衡恢復(fù)，Keap1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與Nrf2一起出核并使Nrf2在胞漿內(nèi)持續(xù)被蛋白體酶降解，Nrf2恢復(fù)至正常水平[20]。研究還發(fā)現(xiàn)，黃芩素能激活 Nrf2 并發(fā)揮抗凋亡作用，其機(jī)理是黃芩素通過Keap1-Nrf2/ARE途徑促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位，降低肝細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，從而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞凋亡[21]。Apaf-1 和 Caspase-9 作為線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷降低了輸卵管組織中Apaf-1和Caspase-9的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡，因?yàn)?，在?xì)胞啟動(dòng)凋亡程序后，Apaf-1和Pro-Caspase-9結(jié)合后可促使 Pro-Caspase-9自身活化并激活其下游的一系列 Caspase 成員，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。

綜上所述， 熱應(yīng)激引起小鼠輸卵管組織氧化損傷，激活Keap1-Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路。黃芩苷可增加Nrf2表達(dá)，提高抗氧化酶和解毒酶活性，抑制凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1和Caspase-9表達(dá)，從而減少熱應(yīng)激狀態(tài)下小鼠輸卵管組織氧化損傷。然而，熱應(yīng)激對(duì)輸卵管所造成的損傷是否會(huì)影響，以及黃芩苷可否提高熱應(yīng)激時(shí)早期胚胎存活率還需進(jìn)一步深入研究。

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