張 輝，周 艷，包紅朵，楊振泉，朱如意，周晨露，張莉莉，王 冉，2

(1.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095; 3.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

噬菌體裂解酶(Bacteriophage lysin)是噬菌體在感染宿主末期表達(dá)的晚期蛋白，它通過(guò)水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖使子代噬菌體釋放，從而殺死細(xì)菌[1]。由于其殺菌高效、作用特異且不易產(chǎn)生耐受等特性，已成為新藥及抗菌制劑的優(yōu)選[2-3]。目前有關(guān)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡(jiǎn)稱李斯特菌)噬菌體裂解酶報(bào)道不斷涌現(xiàn)，前期已有LysZ5用于豆?jié){及LysH5應(yīng)用于牛奶的致病菌生物防控[4-5]，亦有將裂解酶用于動(dòng)物模型治療眼內(nèi)炎等的研究報(bào)道[6]，然而由于裂解酶具有種屬特異性，其結(jié)構(gòu)域的特殊性，使酶作用范圍受到局限，因此不得不將其進(jìn)行多功能設(shè)計(jì)，從而滿足其廣譜的需求。

裂解酶及其他水解酶具有特殊的結(jié)構(gòu)域，其作用方式及模塊都有所不同，如肺炎球菌噬菌體裂解酶的Cholin-binding 結(jié)構(gòu)域發(fā)揮重要催化功能[7]，而金黃色葡萄球菌及乳球菌以細(xì)胞壁水解功能為主[8-9]，李斯特菌噬菌體裂解酶則以酰胺酶為主[10]。雖然裂解酶因其結(jié)構(gòu)功能的特性被分為不同類型，但其最根本還是以酰胺酶及內(nèi)肽酶為主要作用形式。在這些酶中，有一類常見(jiàn)的蛋白家族CHAP (Cysteine，histidine-dependent amidohydrolase/peptidase)，在作為催化結(jié)構(gòu)域時(shí)其表現(xiàn)為酰胺酶活性亦會(huì)表現(xiàn)出內(nèi)肽酶的功能，在裂解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK及Φ11具有高度同源的N末端CHAP及酰胺酶結(jié)構(gòu)域[11-12]，因此，將其CHAP作為主要催化基團(tuán)，并加入特殊的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)SH3b(Bacterial src homology 3)，將有望放大其裂解功能[6]。而針對(duì)李斯特菌噬菌體，與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶裂解功能類似，其也是通過(guò)催化切割 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺殘基將宿主細(xì)胞壁裂解，其裂解酶CBD不僅為種屬特異，甚至是血清或菌株特異[13]，因此，將其與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的酰胺酶活性進(jìn)行結(jié)合，其多功能活性將會(huì)同時(shí)作用于2種病原菌。針對(duì)前期研究報(bào)道，將金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187-KS和李斯特菌噬菌體裂解酶LysZ5進(jìn)行結(jié)構(gòu)域結(jié)合設(shè)計(jì)[6]，構(gòu)建出能夠同時(shí)裂解2種致病菌的重構(gòu)酶，并對(duì)該酶進(jìn)行裂解鑒定和抑菌分析，為今后廣譜抗菌裂解酶的研制及開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)、金黃色葡萄球菌 ATCC25923，用TSB在37 ℃培養(yǎng)；李斯特菌分離株Lm007(血清型2a)，用BHI在30 ℃培養(yǎng)；質(zhì)粒pET 28a及質(zhì)粒pET-LysZ5[5]，以上試驗(yàn)材料均由江蘇省畜禽產(chǎn)品安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 TSB-YE、LB肉湯、瓊脂等購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；腦心浸液(BHI)購(gòu)自美國(guó)BD公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；Ni2+-NTA親合層析柱購(gòu)自GE公司；PEG8000等生化試劑等購(gòu)自汕頭市西隴化工廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 質(zhì)粒ply187-KS序列參考文獻(xiàn)[7]合成并插入原核表達(dá)載體pET 28a相應(yīng)酶切位點(diǎn)，即構(gòu)成表達(dá)質(zhì)粒ply187-KS，將裂解酶LysZ5 C末端CBD以LysZ5為模板PCR擴(kuò)增并克隆至ply187-KS序列下游，構(gòu)建出ply187KS-Z5重構(gòu)酶融合表達(dá)質(zhì)粒，PCR及測(cè)序鑒定其正確性。

1.2.2 重構(gòu)酶質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá) 將質(zhì)粒ply187-KS及ply187KS-Z5分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)篩選陽(yáng)性克隆，挑取克隆鑒定并通過(guò)IPTG進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)IPTG在26 ℃誘導(dǎo)4 h，收集菌體并通過(guò)超聲波破碎，離心過(guò)濾上清，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 蛋白的純化及裂解活性鑒定 將表達(dá)正確的克隆接種LB中(Kan 50 μL/mL)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1∶100再次轉(zhuǎn)接至100 mL LB中，于OD600在0.5～0.8 h，加入1 mmol/L IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，并再次置于26 ℃搖振培養(yǎng)5 h；4 ℃，8 000 r/min離心10 min，PBS重懸，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清，Ni2+-NTA親合層析柱純化表達(dá)蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，并對(duì)不同濃度蛋白進(jìn)行平板點(diǎn)樣分析其裂解活性及裂解范圍。

1.2.4 MIC試驗(yàn) 將酶蛋白從100 μg進(jìn)行倍比稀釋，即100.000 0，50.000 0，25.000 0，12.500 0，6.250 0，3.125 0，1.562 5 μg分別加入100 μL菌液，置于37 ℃，分別在15，30，60 min測(cè)定其OD600，分析最小抑菌濃度。

1.2.5 生肉表面抑菌分析 將生牛肉切成4 cm × 4 cm 肉塊，表達(dá)用70%無(wú)水乙醇進(jìn)行殺菌消毒，待表面干燥后，均勻滴加105cfu 金黃色葡萄球菌和105cfu 李斯特菌，同時(shí)設(shè)立單獨(dú)菌株對(duì)照及PBS空白對(duì)照；待菌液吸收后，再次分別滴加酶蛋白50 μg/100 μL(濃度以MIC結(jié)果為準(zhǔn))，作用1，2，3 h后，分別將肉切成小塊置于錐形瓶中，加入PBS振搖1 h，取上清檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重構(gòu)酶的鑒定及表達(dá)純化

質(zhì)粒通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化及PCR方法鑒定表明，構(gòu)建的片段大小與預(yù)期相符，測(cè)序結(jié)果表明，所構(gòu)建的質(zhì)粒中重構(gòu)酶序列正確。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，對(duì)鑒定正確的克隆進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)結(jié)果表明所構(gòu)建的重構(gòu)酶Ply187KS-Z5在上清中為可溶性表達(dá)，蛋白大小約為58 kDa，Ply187-KS約37 kDa，二者均與預(yù)期相符(圖1)。

A.表達(dá)上清；B.純化蛋白；M.蛋白分子量；1.Ply187-KS；2.Ply187KS-Z5。A.Supernatant of whole expression strain; B. Purified protein;M.Protein Marker; 1.Ply187-KS;2.Ply187KS-Z5.

2.2 重構(gòu)酶的酶活性檢測(cè)

對(duì)純化的裂解酶Ply187-KS及重構(gòu)酶Ply187KS-Z5進(jìn)行裂解活性鑒定，將純化蛋白均點(diǎn)樣于金黃色葡萄球菌 ATCC25923平板，作用8 h后觀察，重構(gòu)酶Ply187KS-Z5及Ply187-KS均能裂解金黃色葡萄球菌，從圖2-A中可以看到明顯的抑菌圈，即結(jié)構(gòu)域的重組并沒(méi)有影響裂解酶對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。同樣將重構(gòu)酶作用于李斯特菌時(shí)(圖2-B)，其與裂解酶LysZ5均能產(chǎn)生透明的裂解圈，與此同時(shí)，Ply187-KS不能夠裂解李斯特菌，LysZ5對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)裂解作用。由此可見(jiàn)，重構(gòu)酶Ply187KS-Z5能夠同時(shí)裂解金黃色葡萄球菌及李斯特菌。

A.金黃色葡萄球菌；B.李斯特菌。A.Staphylococcus aureus; B.Listeria monocytogenes.

2.3 MIC檢測(cè)最佳抑菌濃度

BCA法測(cè)定蛋白濃度，其純化蛋白濃度均高于1 mg/mL，純化效率較高。通過(guò)不同時(shí)間測(cè)定OD600表明，裂解酶Ply187-KS及重構(gòu)酶Ply187KS-Z5的MIC分別為40，48 μg/mL。 因此，在應(yīng)用中以其MIC為參照標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 在食品中的抑菌效果評(píng)價(jià)

將裂解酶Ply187-KS及重構(gòu)酶Ply187KS-Z5分別應(yīng)用于生牛肉表面，分析其在表面的抑菌活性，結(jié)果裂解酶Ply187-KS在作用1 h 后，金黃色葡萄球菌降至1.72 log，重構(gòu)酶Ply187KS-Z5能夠?qū)⑵浣抵?.16 log；而在李斯特菌抑菌組中，Ply187KS-Z5能夠?qū)⑵浣抵?.02 log，Ply187-KS無(wú)抑菌效果(圖3)。由此表明，重構(gòu)酶Ply187KS-Z5能夠同時(shí)抑制金黃色葡萄球菌及李斯特菌在生牛肉表面的污染。

圖3 重構(gòu)酶在生肉表面的抑菌效果分析Fig.3 Inhibition activity of reconstruction lysin on raw beef

3 討論

針對(duì)金黃色葡萄球菌高度耐藥以及食源性李斯特菌污染及對(duì)化學(xué)消毒劑的抵制[14-16]，應(yīng)用噬菌體裂解酶已有報(bào)道，然而裂解酶具有高效特異的特征，如何使其能作用快、范圍廣更能滿足不同需求，就需要進(jìn)行相應(yīng)的完善。先前的研究中提到裂解酶在多次使用后并不產(chǎn)生抗性[17-18]，通過(guò)其結(jié)合結(jié)構(gòu)域作用于細(xì)胞壁，水解細(xì)胞壁最終摧毀細(xì)胞，作用高效且不易產(chǎn)生抗性。研究首次利用金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187 N端的內(nèi)肽酶活性，在其C端引入金黃色葡萄球菌 SH3b區(qū)域(Cell wall-binding domain，CBD)及李斯特菌噬菌體裂解酶LysZ5的C末端CBD區(qū)域的 191 aa，嘗試獲得能夠同時(shí)裂解金黃色葡萄球菌及李斯特菌的重構(gòu)裂解酶，分析結(jié)構(gòu)域重構(gòu)是否與全長(zhǎng)擁有同樣的裂解效果，從而改善多種酶融合導(dǎo)致的表達(dá)效果不高或失敗等問(wèn)題[6]。

針對(duì)其融合蛋白表達(dá)活性分析表明，酶蛋白均有部分可溶性表達(dá)，通過(guò)表達(dá)純化，能夠獲得毫克級(jí)的蛋白量，先前有研究證實(shí)裂解酶抑菌量可達(dá)102～108cfu/mg[19]，而在研究中其抑菌總量可大于106，表明其良好的殺菌活性。在平板中，重組裂解酶蛋白能夠在菌毯表面形成透明裂解圈，在作用1～3 h后，在金黃色葡萄球菌及李斯特菌平板均能觀察到抑菌圈逐漸清晰，由此表明，重組酶蛋白能夠有效抑制2種菌的生長(zhǎng)。對(duì)其酶活性分析表明，Ply187-KS針對(duì)金黃色葡萄球菌較Ply187KS-Z5更佳，這有可能是蛋白分子量較高后導(dǎo)致的反應(yīng)活性降低，而對(duì)李斯特菌Ply187KS-Z5亦有良好的裂解活性。MIC結(jié)果表明，2種蛋白最小抑菌濃度有所不同，其中Ply187-KS較重構(gòu)酶抑菌工作濃度低。此外，將Ply187-KS及李斯特菌噬菌體裂解酶LysZ5進(jìn)行等量混合并同時(shí)作用2種菌后，其抑菌效果良好，但其用量較重構(gòu)酶高(分別為 60，80 μg/mL)。研究亦證實(shí)，Ply187-KS并不會(huì)在多次使用后作用力降低，即不產(chǎn)生抵制現(xiàn)象，從而免除了蛋白類抑菌制劑產(chǎn)生耐受等隱患[6]。由此可見(jiàn)，裂解酶結(jié)構(gòu)域重構(gòu)可以作為多功能酶蛋白構(gòu)建的新方法[20]，而把裂解酶蛋白進(jìn)行有效配比亦能獲得的復(fù)合裂解效果也將是獲得廣譜抗菌的新途徑。此外，亦有將多肽等小分子進(jìn)行聯(lián)合構(gòu)建等方法使酶譜擴(kuò)大[21]，同樣早期還有將酶與抗生素聯(lián)用等發(fā)揮協(xié)同抗菌等的研究[22]，這些不僅能放大酶的作用同時(shí)也會(huì)降低抗生素的用量，都將會(huì)給裂解酶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

將重構(gòu)酶進(jìn)行抑菌應(yīng)用效果分析，在作用1 h后，能夠分別抑制金黃色葡萄球菌及李斯特菌的生長(zhǎng)，Ply187-KS及Ply187KS-Z5均能夠抑制金黃色葡萄球菌，作用效果相當(dāng)，但同時(shí)也能夠有效抑制2種病原菌的生長(zhǎng)，目前還沒(méi)有將2種菌進(jìn)行重構(gòu)的報(bào)道，從而表明其在廣譜活性研發(fā)方面，結(jié)構(gòu)域的重組將具有良好的開(kāi)發(fā)潛力。目前，已有嵌合裂解酶如ClyS、P128等進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，美國(guó)Contrafect公司也推出針對(duì)金黃色葡萄球菌的酶產(chǎn)品CF-301，因此，通過(guò)結(jié)構(gòu)域的重新結(jié)合將有可能獲得更為高效的多功能酶產(chǎn)品。

由于裂解作用高效，在30 min就能夠發(fā)揮效果，且在抑制菌的過(guò)程中自身亦會(huì)隨著時(shí)間的增加而降解，因此，無(wú)殘留不易產(chǎn)生抗性。面對(duì)目前的耐藥現(xiàn)狀，裂解酶顯示其較抗生素優(yōu)越的特征，在未來(lái)抗菌藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中都具有潛在的價(jià)值，而結(jié)構(gòu)域重構(gòu)能夠使酶獲得多重功能且不影響其活性，必將成為新型功能酶合成的全新方式。

[1] Pastagia M，Schuch R，F(xiàn)ischetti V A，et al.Lysins：the arrival of pathogen-directed anti-infectives[J].Journal of Medical Microbiology，2013，62(10)：1506-1516.

[2] Schmelcher M，Donovan D M，Loessner M J.Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials[J].Future Microbiology，2012，7(10)：1147-1171.

[3] Schuch R，Pelzek A J，Raz A，et al.Use of a bacteriophage lysin to identify a novel target for antimicrobial development[J].PLoS One，2013，8(4)：e60754.

[4] Zhang H，Bao H，Billington C，et al.Isolation and lytic activity of theListeriabacteriophageendolysin LysZ5 againstListeriamonocytogenesin soya milk[J].Food Microbiology，2012，31(1)：133-136.

[5] Obeso J M，Martinez B，Rodriguez A，et al.Lytic activity of the recombinant staphylococcal bacteriophage Phi H5 endolysin active againstStaphylococcusaureusin milk[J].International Journal of Food Microbiology，2008，128(2)：212-218.

[6] Singh P K，Donovan D M，Kumar A.Intravitreal injection of the chimeric phage endolysin Ply187 protects mice fromStaphylococcusaureusendophthalmitis[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2014，58(8)：4621-4629.

[7] Croux C，Ronda C，López R，et al.Interchange of functional domains switches enzyme specificity：construction of a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme[J].Molecular Microbiology，1993，9(5)：1019-1025.

[8] Oshida T，Sugai M，Komatsuzawa H，et al.AStaphylococcusaureusautolysin that has an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase domain and an endo-beta-N-acetylglucosaminidase domain：cloning，sequence analysis，and characterization[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1995，92(1)：285-289.

[9] Sheehan M M，García J L，López R，et al.Analysis of the catalytic domain of the lysin of the lactococcal bacteriophage Tuc2009 by chimeric gene assembling[J].FEMS Microbiology Letters，1996，140(1)：23-28.

[10] Milohanic E，Jonquières R，Cossart P，et al.The autolysin Ami contributes to the adhesion ofListeriamonocytogenesto eukaryotic cells via its cell wall anchor[J].Molecular Microbiology，2001，39(5)：1212-1224.

[11] Becker S C，F(xiàn)oster-Frey J，Stodola A J，et al.Differentially conserved staphylococcal SH3b_5 cell wall binding domains confer increased staphylolytic and streptolytic activity to a streptococcal prophage endolysin domain[J].Gene，2009，443(1/2)：32-41.

[12] Horgan M，O′flynn G，Garry J，et al.Phage lysin LysK can be truncated to its CHAP domain and retain lytic activity against live antibiotic-resistant staphylococci[J].Applied and Environmental Microbiology，2009，75(3)：872-874.

[13] Schmelcher M，Shabarova T，Eugster M R，et al.Rapid multiplex detection and differentiation ofListeriacells by use of fluorescent phage endolysin cell wall binding domains[J].Applied and Environmental Microbiology，2010，76(17)：5745-5756.

[14] 張志軍，曹海燕，劉延媛，等.醫(yī)院感染金黃色葡萄球菌耐藥表型與耐藥基因研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25(9)：1924-1926.

[15] 趙 薇，劉桂華，王艷秋，等.食品中單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染及耐藥狀況調(diào)查[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012(6)：1394-1395.

[16] Romanova N，F(xiàn)avrin S，Griffiths M W.Sensitivity ofListeriamonocytogenesto sanitizers used in the meat processing industry[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68(12)：6405-6409.

[17] Rodríguez-Rubio L，Martínez B，Rodríguez A，et al.The phage lytic proteins from theStaphylococcusaureusbacteriophage vB_SauS-phiIPLA88 display multiple active catalytic domains and do not trigger staphylococcal resistance[J].PLoS One，2013，8(5)：e64671.

[18] Shen Y，Mitchell M S，Donovan D M，et al.Phage-based Enzybiotics[M]//Hyman P，Abedon S T.Bacteriophages in health and disease.Wallingford，UK：CAB International,2012：217-239.

[19] Fukushima T，Yao Y，Kitajima T，et al.Characterization of new L，D-endopeptidase gene productCwlK(previous YcdD) that hydrolyzes peptidoglycan inBacillussubtilis[J].Molecular Genetics and Genomics，2007，278(4)：371-383.

[20] Wang S，Gu J，Lv M，et al.The antibacterial activity ofE.colibacteriophage lysin lysep3 is enhanced by fusing theBacillusamyloliquefaciensbacteriophage endolysin binding domain D8 to the C-terminal region[J].Journal of Microbiology，2017，55(5)：403-408.

[21] Ma Q，Guo Z，Gao C，et al.Enhancement of the direct antimicrobial activity of Lysep3 againstEscherichiacoliby inserting cationic peptides into its C terminus[J].Antonie Van Leeuwenhoek，2017，110(3)：347-355.

[22] Djurkovic S，Loeffler J M，F(xiàn)ischetti V A.Synergistic killing ofStreptococcuspneumoniaewith the bacteriophage lytic enzyme Cpl-1 and penicillin or gentamicin depends on the level of penicillin resistance[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49(3)：1225-1228.