鐵 英，楊成林，常 誠，王耀輝，孫鴻舉

(1.內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限責任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.呼和浩特啟秀中學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古大學 生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

植物依賴細胞質(zhì)膜模式識別受體(Pattern-recognition receptors，PRRs)來識別微生物表面的特異組分，即病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)[1]。這是植物先天免疫的核心機制。植物的模式識別受體和微生物表面的病原相關(guān)分子模式相互識別以后，會誘導植物細胞內(nèi)信號分子的瞬時升高，主要有細胞質(zhì)Ca和一氧化氮(NO)，進一步誘導下游基因表達。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的保守成分，具有3個保守的結(jié)構(gòu)：脂A、核心寡糖和O-側(cè)鏈[2]。LPS是細菌黏附在植物表面的必需組分[3-5]。植物細胞對于LPS具有多層的先天免疫反應，包括活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)和細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]cyt)的瞬時升高[6-9]，以及下游胼胝質(zhì)在細胞壁的沉積和防御基因表達[10]。哺乳動物細胞對LPS的識別依賴于細胞質(zhì)膜中的TLR4(Toll-Like Receptor4 )復合體[11]，該復合體由LPS結(jié)合蛋白(LPS-Binding Protein ，LBP)、糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白(CD14)、髓樣細胞分化蛋白2(Myeloid Differentiation Protein2，MD2)和TLR4蛋白組成。LBP首先與LPS結(jié)合，形成LPS-LBP復合體，然后與CD14互作，形成LPS-LBP-CD14復合體[12-14]。形成的三元復合體將LPS轉(zhuǎn)移到MD2，MD2是TLR4重要的輔助因子。最終激活TLR4并依次打開下游的信號轉(zhuǎn)導通路。TLR4具有3個結(jié)構(gòu)域，細胞的亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域、跨膜域和細胞質(zhì)內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)植物的防御反應被100 ng/mL的LPS激活，而在動物中是在pg到ng之間[15-16]，植物脂多糖受體對LPS的親和性與動物相比存在差異。通過氨基酸比對，我們發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtGHR1蛋白序列同動物細胞的TLR4類似。本研究主要探索了AtGHR1介導的擬南芥對LPS的先天免疫反應。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的擬南芥野生型材料 (Columbia ecotype，Col-0)、大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101由內(nèi)蒙古大學祁智教授實驗室保存；擬南芥缺失型突變體atghr1-1來源于中國農(nóng)業(yè)大學鞏志忠老師；atghr1-2(salk_031493)購自擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)；Primer Star HS DNA Polymerase購自TaKaRa；EasyTaq PCR Supermix DNA聚合酶和T4DNA連接酶購自全式金公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000購自擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)；表達載體pORE-R1、pORE-R3購自擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)；其他化學試劑購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1AtGHR1編碼蛋白的亞細胞定位 以擬南芥野生型Col-0 cDNA為模板，擴增AtGHR1基因的2 934 bp編碼序列，所用引物為5′-AAAGCGGCCGCTGGGGCAACTTCCATCACAG-3′和5′-CCCATCGAT TGCTGCTGCAATAGAAGAAAGATCTTCG-3′。以擬南芥野生型Col-0 基因組DNA為模板，擴增AtGHR1的1 477 bp啟動子序列，所用引物為5′-TTTCCGCGG CTAGTCAACGTAGTCAGCATGTGG-3′和5′-CCGAAC GTTTGCAGATAGAAAAAACATGGAG-3′。將上述擴增產(chǎn)物克隆連入pEASY-T1(全式金)載體上，然后分別轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中測序，測序正確后將AtGHR1啟動子和AtGHR1基因克隆入雙元載體pORE R3并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。將帶有AtGHR1基因的農(nóng)桿菌與帶有膜標記蛋白 AtPIP2A∷mCherry 的農(nóng)桿菌共同注入生長32 d的煙草(Nicotianabenthamiana)葉片中，用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510 )記錄熒光位置。

1.2.2 擬南芥中AtGHR1 啟動子的活性檢測 將AtGHR1啟動子擴增產(chǎn)物克隆到pEASY-T1(全式金)載體上，然后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中。將測序正確的AtGHR1啟動子克隆入雙元載體pORE R1報告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的上游并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。利用農(nóng)桿菌侵染擬南芥野生型Col-0花序，通過抗生素篩選T1陽性苗并進行繁種，繼續(xù)篩選尋找純合體陽性苗。將純合體陽性苗進行GUS酶活染色，檢測AtGHR1 啟動子的活性。

1.2.3 病原菌感病試驗 將擬南芥野生型和突變體atghr1播種在含有1%蔗糖，0.4% Phytagel的1/2 MS基本培養(yǎng)基上，水平生長21 d。在無菌條件下，用無菌水和濃度為5×105cfu/mL的Pst DC3000(guard cell hydrogen peroxide-resistant1)懸液淹沒幼苗3 min，然后倒掉懸液，并用滅菌的濾紙吸干剩余的懸液。用透氣醫(yī)用膠布封好培養(yǎng)皿，放到光照培養(yǎng)箱觀察表型。葉片內(nèi)細菌的擴繁密度測定依照Chinchilla等[16]的研究方法。

1.2.4 活性氧的測量 將野生型Col-0與突變體atghr1-1、atghr1-2播種在含1%蔗糖的1/2 MS基本培養(yǎng)基上，水平生長，21 d后分別取1片葉片浸沒于100 μL滅菌水中于24 ℃暗室過夜。在弱光條件下用100 μL發(fā)光液(0.2 mmol/L魯米諾和20 μg/mL辣根過氧化物酶的水溶液)置換100 μL無菌水，并靜置30 min以上[17]。將樣品置于化學熒光測試儀(Luminometer，Turner Biosystem，20/20)測10個計數(shù)為背景值(1個計數(shù)/10 s)，吸取100 μL 200 μg/mL LPS處理液快速加入樣品中并測量，LPS終濃度為100 μg/mL。

1.2.5 細胞質(zhì)鈣離子的測量 利用花粉雜交產(chǎn)生細胞質(zhì)中穩(wěn)定表達水母發(fā)光蛋白的植株Col-0∷aequorin和atglr1-2∷aequorin，將2種植株單個葉片放入1.5 mL離心管中，加入100 μL測鈣緩沖液(1 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，5 mmol/L MES，pH值5.7)，保證植物葉片完全浸入溶液中。在黑暗條件下加入腔腸熒光素(500 μmol/L母液)，測試濃度為5 mmol/L(100 μL測鈣溶液中加入1 μL腔腸熒光素)，黑暗處理4 h以上[17]。放入化學熒光測試儀(Luminometer，Turner Biosystem，20/20)，每秒一個點進行檢測。首先測100個點的背景值，暫停，加入100 μL 200 μg/mL LPS處理液，LPS終濃度達到100 μg/mL，記錄結(jié)果。

1.2.6 植物保衛(wèi)細胞內(nèi)NO的檢測 用鑷子撕取野生型Col-0與突變體atghr1-1、atghr1-2的下表皮，用含 5 μmol/L DAF-FM DA (4-氨基，5-甲基氨基，2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯)的對照緩沖液(1.0 mmol/L CaCl2，2.5 mmol/L MgCl2，pH值7.6)處理30 min。分別用無菌水或 100 μg/mL LPS處理，產(chǎn)生綠色熒光的保衛(wèi)細胞用尼康 Eclipse Ti 熒光倒置顯微鏡觀察。為定量DAF-FM DA 熒光，使用 Adobe Photoshop 7.0.1 (Adobe Systems，San Jose，CA，USA) 測量保衛(wèi)細胞照片的灰度值。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組分析 將Col-0 和atghr1-2播種于0.4% 凝膠的1/2MS 培養(yǎng)基上生長21 d后，用無菌水或 100 μg/mL LPS淹沒擬南芥Col-0 或atghr1-2 的幼苗，36 h 后提取葉子的 RNA。送北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司做芯片試驗，重復3次試驗。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析后分別從上調(diào)基因和下調(diào)基因中各選5個基因進行定量PCR驗證。用于檢測基因芯片結(jié)果上調(diào)基因和下調(diào)基因定量PCR引物序列見表1。

表1 定量 PCR引物序列Tab.1 Primers used for real time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 AtGHR1啟動子的活性檢測

為了研究AtGHR1基因表達的組織特異性，筆者構(gòu)建了AtGHR1啟動子和編碼β-葡萄糖苷酸酶報告基因(GUS)的融合DNA片段ProAtGHR1∷GUS，通過農(nóng)桿菌介導的花序侵染法，整合到擬南芥基因組中，得到含有ProAtGHR1∷GUS的轉(zhuǎn)基因植物，在GUS底物X-Glu存在的條件下，進一步通過組織化學染色發(fā)現(xiàn)AtGHR1啟動子活性主要集中在根尖和葉脈，在葉子保衛(wèi)細胞中有相對較弱的活性(圖1)。

2.2 AtGHR1的亞細胞定位

為了確定AtGHR1基因編碼蛋白在細胞內(nèi)的位置，構(gòu)建了AtGHR1啟動子驅(qū)動的AtGHR1和綠色熒光蛋白(GFP)編碼序列的融合DNA片段ProAtGHR1∷AtGHR1-GFP。進一步在煙草葉片內(nèi)瞬時表達ProAtGHR1∷AtGHR1-GFP和編碼細胞質(zhì)膜標記蛋白基因35S∷AtPIP2A-mCherry。在不同激發(fā)光照射的條件下，發(fā)現(xiàn)ProAtGHR1∷AtGHR1-GFP的綠色熒光和35S∷AtPIP2A-mCherry紅色熒光完全重合，表明AtGHR1蛋白位于細胞質(zhì)膜(圖2)。

2.3 AtGHR1參與脂多糖誘導防御反應

為了研究AtGHR1基因是否參與植物對含有LPS病原菌的防御反應，用含有和不含有Pst DC3000病原菌的水溶液短暫淹沒生長在培養(yǎng)基上的擬南芥野生型Col-0和2個缺失AtGHR1基因的突變體，atghr1-1以及atghr1-2。不含有Pst DC3000病原菌的水溶液的短暫淹沒，對植物生長沒有明顯作用(圖3)。但是，含有Pst DC3000病原菌的水溶液的短暫淹沒引起植物葉子黃化死亡。相對而言，atghr1突變體葉子黃化死亡程度更重。為了量化植物對病原菌Pst DC3000的感病程度(圖3)，對葉子內(nèi)病原菌密度進行了統(tǒng)計，葉片注菌1 d以后，無論野生型還是突變體葉子內(nèi)菌密度含量都顯著高于0 d，但是野生型和突變體之間沒有顯著區(qū)別(圖3-B)。葉片注菌2 d以后，野生型還是突變體葉子內(nèi)菌密度含量相對0，1 d繼續(xù)顯著升高，同時突變體葉子內(nèi)菌密度顯著高于野生型(圖3)，說明atghr1更感病，證明GHR1基因是植物防御Pst DC3000病原菌必需基因。

A.幼苗；B.葉片；C.葉脈；D.保衛(wèi)細胞；E.根。A.Young seedling;B.Leaf;C.Vein；D.Guard cell；E.Root.

A.綠色通道；B.紅色通道；C.明場；D.綠色通道和紅色通道的合并。 A.Green channel；B.Red channel；C.Light field；D.Co-localization of green and red channel.

A.分別用H2O或含有Pst DC3000病原菌水溶液淹沒植物3 min，倒掉溶液2 d以后的表型；B.對經(jīng)過病原菌侵染植物葉片中病原菌的密度進行統(tǒng)計分析結(jié)果，數(shù)據(jù)標記不同字母表示t-檢驗，P<0.01。圖4-6同。

A.The seedlings were floated with either H2O or H2O containing Pst DC3000 for 3 minutes，after the solution was discard，the seedling phenotype was displayed two-day later；B.Statistical analysis of the pathogen density,data with different letter indicatesP<0.01 witht-test.The same as Fig.4-6.

圖3擬南芥野生型Col-0和atghr1突變體對PstDC3000病原菌的反應
Fig.3ArabidopsiswildtypeCol-0andatghr1mutantresponsetoPstDC3000

2.4 AtGHR1不參與LPS誘導H2O2和細胞質(zhì)中Ca2+濃度升高

已有研究表明，H2O2和細胞質(zhì)Ca參與了植物對LPS的感應過程。為了探索AtGHR1基因是否介導LPS對植物細胞H2O2和細胞質(zhì)Ca的調(diào)節(jié)作用，首先將野生型Col-0 與突變體atghr1-1、atghr1-2播種在含1%蔗糖的1/2MS基本培養(yǎng)基上，21 d后分別取1片葉片，利用化學發(fā)光法對H2O2含量進行測量。圖4結(jié)果表明，LPS處理誘導的H2O2含量，在野生型Col-0 與突變體atghr1-1、atghr1-2葉片之間沒有顯著區(qū)別，說明AtGHR1不參與LPS誘導H2O2的產(chǎn)生。

為了檢測細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度，將編碼水母發(fā)光蛋白aequorin的基因?qū)霐M南芥野生型和atglr1-2突變體中，形成Col-0∷aequorin和atglr1-2∷aequorin轉(zhuǎn)基因植物。水母發(fā)光蛋白在底物腔腸熒光素存在的情況下，和Ca2+結(jié)合以后發(fā)出470 nm的熒光，熒光強度和Ca2+濃度呈正相關(guān)，從而可以通過檢測水母發(fā)光蛋白的熒光強度間接檢測細胞質(zhì)的Ca2+濃度。圖5檢測結(jié)果表明，LPS處理導致植株Col-0∷aequorin和atglr1-2∷aequorin細胞質(zhì)中Ca2+濃度顯著升高，但是在Col-0∷aequorin和atglr1-2∷aequorin之間沒有顯著區(qū)別，說明AtGHR1不參與LPS誘導細胞質(zhì)Ca2+升高的過程。

圖4 LPS誘導野生型Col-0 與突變體ghr1葉片產(chǎn)生的H2O2Fig.4 LPS induced H2O2 production in leaf of Arabidopsis Col-0 and mutant ghr1

圖5 LPS處理 Col-0∷aequorin(Col-0∷AEQ)和atglr1-2∷aequorin(atghr1-2∷AEQ)葉子的鈣信號值Fig.5 The LPS induced[Ca2+]cyt rise in Col-0∷aequorin(Col-0∷AEQ) and atghr1-2∷aequorin (atghr1-2∷AEQ)

2.5 AtGHR1參與LPS誘導NO的產(chǎn)生

已有研究表明，LPS可以誘導擬南芥保衛(wèi)細胞內(nèi)NO的產(chǎn)生。利用NO特異的熒光探針DAF-FM 對擬南芥野生型和atghr1突變體保衛(wèi)細胞內(nèi)的NO進行檢測。相對于H2O處理，在LPS處理條件下，擬南芥野生型Col-0保衛(wèi)細胞內(nèi)產(chǎn)生大量綠色熒光。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在LPS處理條件下，變體atghr1-1和atghr1-2保衛(wèi)細胞內(nèi)產(chǎn)生的NO顯著低于野生型擬南芥Col-0，說明AtGHR1參與LPS誘導保衛(wèi)細胞內(nèi)NO的產(chǎn)生(圖6)。

A.LPS處理以后，擬南芥野生型Col-0和突變體atghr1-2保衛(wèi)細胞內(nèi)NO熒光圖；B.NO熒光強度的相對定量。A.The NO fluorescent image in the guard cells of Arabidopsis Col-0 and mutant atghr1-2；B.Relative quantitation of the NO fluorescent density.

圖7 LPS處理野生型Col-0與突變體atghr1-2芯片轉(zhuǎn)率組分析上調(diào)與下調(diào)基因數(shù)目結(jié)果Fig.7 LPS-induced transcriptional response in Col-0 and atglr1-2 of up-regulated gene and down-regulated genenumbers

2.6 AtGHR1參與LPS誘導的擬南芥基因轉(zhuǎn)錄應答

用H2O 和 100 μg/mL LPS處理生長在培養(yǎng)皿中的擬南芥Col-0 和 突變體atghr1-2幼苗，36 h 后提取葉子的 RNA，送公司做基于芯片的轉(zhuǎn)錄組分析試驗。圖7結(jié)果表明，用LPS處理Col-0導致547個基因上調(diào)，701個基因下調(diào)。其中由AtGHR1介導的上調(diào)基因145個，下調(diào)基因211個。從上調(diào)基因和下調(diào)基因中各選5個基因進行定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果在變化趨勢上相符(圖8)。

圖8 LPS調(diào)節(jié)擬南芥野生型和突變體atghr1-2基因表達的定量PCR分析

3 結(jié)論與討論

在動物細胞中，位于細胞質(zhì)膜的TLR4蛋白可以識別細菌性病原菌上的LPS，而位于細胞質(zhì)膜的TLR5蛋白可以識別細菌性病原菌上的鞭毛蛋白[18]。在擬南芥中，識別細菌編碼蛋白的受體是FLS2，其氨基酸序列同動物細胞的TLR5相似[19]。本研究利用動物細胞識別LPS的TLR4蛋白的氨基酸序列，搜索擬南芥基因組，鑒定到AtGHR1和TLR4的序列最相似。進一步通過基因缺失突變體和細胞生物學技術(shù)證明，擬南芥AtGHR1參與植物對細菌性病原菌的感應。

以前的研究發(fā)現(xiàn)，AtGHR1在ABA誘導氣孔關(guān)閉信號轉(zhuǎn)導途徑中位于H2O2的下游[20]。與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)，AtGHR1不參與LPS對植物H2O2和細胞質(zhì)Ca2+的調(diào)節(jié)作用。但是，缺失AtGHR1基因的突變體部分喪失LPS對NO的誘導作用，這一方面說明，LPS調(diào)節(jié)NO合成存在不依賴AtGHR1的途徑，另一方面說明，細菌LPS對植物細胞H2O2、Ca2+和NO信號分子的調(diào)節(jié)機理是完全不同的。以前的研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥保衛(wèi)細胞內(nèi)AtGHR1參與H2O2激發(fā)SLAC1陽離子通道和細胞外Ca2+跨膜內(nèi)流[20]。在本研究中，筆者以擬南芥整個葉子為材料發(fā)現(xiàn)AtGHR1不參與LPS對細胞質(zhì)Ca2+的調(diào)節(jié)，這個區(qū)別可能是因為研究的具體細胞和具體的處理不同而導致。

AtGHR1基因的缺失并沒有完全阻斷LPS對保衛(wèi)細胞內(nèi)NO濃度和葉子基因表達的調(diào)節(jié)作用，這說明LPS在植物葉子中的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑不完全依賴AtGHR1。在動物細胞內(nèi)，LPS信號轉(zhuǎn)導途徑依賴TLR4受體復合體，包括CD14和MD2蛋白[15]。筆者利用動物細胞CD14蛋白氨基酸序列搜索擬南芥基因組，發(fā)現(xiàn)CD14同擬南芥At4g22130高度同源，這個基因編碼蛋白為Strubbelig-receptor family 8，但是這個基因的功能還沒有任何報道，可能會和AtGHR1形成復合體參與對LPS的感應過程。同時，筆者在擬南芥基因組中沒有找到同動物MD2蛋白氨基酸序列相似的同源物。這些初步的分析表明，植物細胞中有可能存在LPS受體復合體，但是這個受體復合體的組成和動物細胞中的TLR4、CD14、MD2復合體是不同的。

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