張德雙，趙 泓，張鳳蘭，余陽俊，趙岫云，于拴倉，汪維紅，蘇同兵，盧桂香

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心，北京 100097)

大白菜(Brassica.rapaL.ssp.pekinensis)起源于中國，種質(zhì)資源豐富、生態(tài)類型多樣，是名副其實(shí)的大眾化蔬菜。隨著居民生活質(zhì)量的提高和家庭消費(fèi)模式、人口結(jié)構(gòu)的改變，大白菜富含的蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、維生素C、膳食纖維、胡蘿卜素以及花青苷等營養(yǎng)品質(zhì)日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。大白菜品種類型多樣，繼黃心、桔紅心大白菜后，近幾年育種家又成功選育出紫色葉球大白菜。紫色葉球大白菜色澤艷麗、風(fēng)味獨(dú)特，富含花青苷等營養(yǎng)成分，逐漸被消費(fèi)者接納和喜愛。植物體內(nèi)的花青素為水溶性色素，在自然條件下不能穩(wěn)定存在，常常結(jié)合一個或多個糖苷，形成花青苷。花青苷是黃酮類次生代謝產(chǎn)物，在植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，然后運(yùn)輸?shù)揭号莶⒎e累，可以引起植物的葉片、花薹、根莖和種莢等呈現(xiàn)紫色、紅色、藍(lán)色和粉色等顏色，如甘藍(lán)類的紫紅色甘藍(lán)、紫色羽衣甘藍(lán)、紫色苤藍(lán)和白菜類的紅菜薹、紫色小白菜和紫紅色蕪菁等。花青苷具有吸引昆蟲傳粉和抵御低溫、紫外線傷害以及防治植物病害等多種生理功能；也具有抗氧化衰老、抗癌、抗動脈硬化，減少夜盲癥和預(yù)防近視，防止神經(jīng)紊亂以及增強(qiáng)人體免疫力等重要的醫(yī)療保健功能；花青素還是一種安全的天然食用色素。花青素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑，抗自由基氧化能力是VC的20倍、VE的50倍，并且對光、熱和氧等穩(wěn)定性好。因此，花青素在園藝、醫(yī)藥、化妝及食品等方面具有重要的應(yīng)用價值和研究意義[1]。

目前，紫色大白菜來源主要有4種：紫紅色芥菜[2]、紫色小白菜[3-6]、紫菜薹[7]和紫紅色蕪菁[8]。在國內(nèi)，已育成紫羅蘭、紫冠一號、紫貴妃等小白菜品種和京研紫快菜等大白菜品種，但是紫色性狀均來源于紫色小白菜，其紫色僅分布在葉片的正面，而在葉片的反面和葉柄處沒有分布，且葉球剖面顏色不均勻，表現(xiàn)為雜色[3-4]，因此，該紫色性狀存在一定的局限性，無法廣泛利用。當(dāng)前，國內(nèi)還沒有利用另外3種紫色性狀育成白菜品種的報(bào)道。近年來，在國際上韓國首次培育出紫色大白菜品種紫寶(http：//www.1688.com/chanpin/D7CFB0D7B2CB.html)，該品種為細(xì)胞質(zhì)不育系配制的雜交F1，紫色均勻分布在葉片的正反面、葉脈和葉柄處，且葉球剖面紫色分布均勻，顏色美觀，但是由于細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有自我保護(hù)的生物學(xué)功能，即細(xì)胞質(zhì)母性遺傳的特點(diǎn)，不能產(chǎn)生花粉，無法自交留種，所以該紫色資源也無法應(yīng)用。目前，紫寶由國內(nèi)代理公司銷售，品種名稱也不同，且種子價格昂貴，每粒種子平均售價為0.8～1.0元。2014年Ahmed等[9]報(bào)道了全紫色大白菜材料Palgangbaechu和部分紫色材料8053。2016年，韓國又推出了大白菜紫色品種紫裔。當(dāng)前，有關(guān)紫寶、紫裔、Palgangbaechu和8053等紫色性狀的來源仍不清楚，猜測有可能來源于紫色芥菜。

轉(zhuǎn)錄組是基因組遺傳信息與生物功能蛋白質(zhì)組相連接的必然紐帶，也是研究基因功能及結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究等多個領(lǐng)域。轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，目前主要是mRNA。通過新一代高通量測序技術(shù)，能夠全面快速地獲得紫色大白菜葉片在特定狀態(tài)下的幾乎全部轉(zhuǎn)錄本序列信息，特別是有關(guān)類黃酮、黃酮、黃酮醇和花青素合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本信息，有利于獲得差異表達(dá)的基因，闡明調(diào)控葉片花青苷合成相關(guān)基因的分子機(jī)制[10-11]。

2015年春季，筆者在1份繁育的小白菜雜交一代中發(fā)現(xiàn)了1株紫色材料，不僅紫色性狀突出，而且葉片正反面、葉脈和葉柄均表現(xiàn)為紫色，命名為15NG28。隨后，將15NG28與大白菜雜交、回交，繼續(xù)轉(zhuǎn)育該紫色性狀，已初步創(chuàng)制了一批大白菜新型紫色資源材料。本研究擬開展15NG28及其雜交F1、回交一代BC1F1和自交等后代的植物學(xué)性狀、基因組的倍性和染色體數(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究，為拓寬新的紫色大白菜資源，最終選育出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的深紫色白菜新品種并進(jìn)一步獲得控制15NG28紫色葉片花青苷合成途徑候選基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年4月，選用2份大白菜(1份春白菜15綠1-1-26，1份秋白菜16-1081)，分別與15NG28雜交，配制3組F1：15NG28×16-1081、15NG28×15綠1-1-26和15綠1-1-26×15NG28，同時在蕾期對15NG28進(jìn)行人工剝蕾、自交授粉，收獲全部種子。12月18日，在溫室中播種15NG28自交種子、3組F1材料。2016年1月13日開始，觀察全部材料葉片在幼苗期和成株期的紫色性狀，并拍照。4月，配制回交一代BC1F1：16M-170-22×15綠1-1-26，收獲全部種子。12月20日，播種2組BC1F1種子，2017年4月，觀察2組BC1F1葉片紫色性狀，并拍照，同時在蕾期對紫色BC1F1進(jìn)行人工剝蕾、自交授粉，紫色BC1F1繼續(xù)與白菜進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育。試驗(yàn)材料均來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心大白菜課題。所用試驗(yàn)材料的世代、名稱和特性見表1。

表1 材料的世代、名稱和特性Tab.1 Generation，name and characteristics of materials

1.2 觀察葉片中花青素的分布情況

采用徒手切片的方法，將2把刀片并排重疊，快速切取紫色和綠色葉片，放于清水中，并用毛筆撈取，置于載玻片上，在顯微鏡下觀察葉片中花青素的分布情況。

1.3 觀察基因組倍性

參考饒琳莉[12]的方法并進(jìn)行優(yōu)化，觀察樣品的基因組倍性，具體操作為：選取樣品新鮮嫩葉100 mg，加入1 mL預(yù)冷的緩沖液Galbraith(45 mmol/L MgCl2，30 mmol/L檸檬酸納，20 mmol/L MOPS，0.1% Triton X，pH=7)于培養(yǎng)皿中，用鋒利的刀片快速切碎嫩葉，再用50 μm孔徑的尼龍膜過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入200 μL PI染液，振蕩混勻，避光靜置20 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析并拍照。試驗(yàn)在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心生物技術(shù)研究室完成。

1.4 染色體數(shù)觀察

在晴天上午(9：00-11：00)，選取植株盛花期花序上端的幼小花蕾，用卡諾氏液(V(無水酒精)∶V(冰乙酸)=3∶1)固定24 h，再換至70%乙醇中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以改良品紅溶液染色，常規(guī)壓片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目并拍照。試驗(yàn)完成地點(diǎn)同1.3。

1.5 轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq分析

選取F1紫色植株16M-170-22、BC1F1紫色植株17M-245-21和17M-247-22、F1綠色植株16M-170-23的葉片，3次生物學(xué)重復(fù)，送交杭州壹基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并獲得測序結(jié)果報(bào)告。

獲得差異表達(dá)基因的方法：以紫色單株BCZ為參考，對綠色單株BCL與紫色單株BCZ基因表達(dá)量FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)進(jìn)行比較，即BCL-VS-BCZ，再依據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR(False Discovery Rate)篩除假陽性，最終獲得BCZ、BCL 2個樣品之間的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 15NG28植物學(xué)性狀

觀察15NG28葉片顏色性狀，結(jié)果表明，在幼苗期，15NG28的子葉和真葉正反面，葉柄、葉脈均為紫色；在成株期，15NG28葉片為長圓形，葉緣淺鋸齒，葉柄窄，葉柄正面為紫色、背面為綠色，葉柄沒有葉翼(圖1)。由于在繁育的普通小白菜雜交種中發(fā)現(xiàn)15NG28材料，所以可以肯定15NG28是以小白菜為母本、父本未知的F1雜交種，因此，15NG28表現(xiàn)為中間類型，偏向小白菜，但不表現(xiàn)白菜的抱球、小白菜的束腰等性狀(圖1)，也沒有典型剖面特征；在花期，15NG28花瓣顏色為黃色，花蕾小，花瓣、花藥和柱頭等花器官也小，花粉偏少，但腋芽萌生能力特別旺盛，花枝細(xì)長且軟。15NG28自交結(jié)實(shí)結(jié)果表明：15NG28自交結(jié)實(shí)率極低。

A.全株；B.葉柄。A.Whole plant；B.Leaf blade.

2.2 15NG28與白菜雜交的F1性狀

以15NG28為母本，分別與大白菜15綠1-1-26和16-1081雜交，均可以獲得少部分F1種子，而以15NG28為父本與15綠1-1-26雜交，后代結(jié)實(shí)率很高。比較15NG28及其3組F1植株葉片性狀，結(jié)果表明：以15NG28為母本的2組雜交F1(15NG28×16-1081、15NG28×15綠1-1-26)，其葉片顏色出現(xiàn)了分離，表現(xiàn)為紫色和綠色2類(表2)。其中紫色F1的子葉、真葉正反面均為紫色，特別是葉脈和葉柄也為紫色，且顏色深(圖2-4)。另外，調(diào)查了雜交F1(15綠1-1-26×15NG28)的性狀，結(jié)果表明：9株F1植株全部表現(xiàn)為綠色，而且植物學(xué)性狀相似，因此，這9株F1應(yīng)該為自交種。同時，調(diào)查了紫色F1植株16M-170-21現(xiàn)蕾期、抽薹期和開花期的性狀，結(jié)果表明：隨著植株逐漸經(jīng)歷現(xiàn)蕾期、抽薹期和開花期的過程，葉片紫色逐漸褪色、變淺和變綠，在花期，只有葉脈部分呈現(xiàn)出零星紫色，因此，紫色F1植株葉片紫色由深到淺的顯色順序?yàn)椋好缙?現(xiàn)蕾期>抽薹期>開花期(圖2，5)?？梢姡贸Ｒ?guī)雜交的方法，可以獲得少部分15NG28與大白菜的雜交F1種子，且F1后代分離出部分紫色植株。

表2 15NG28及其雜交F1的性狀Tab.2 Characteristics of 15NG28 and it′s F1 hybrids

A.16M-170-21；B.16M-170-22；C.16M-171-24；D.16M-171-26。

圖3 16M-170-22苗期真葉反面性狀Fig.3 Abaxial leaf characteristics of 16M-170-22 at seedling stage

A.16M-171-24；B.16M-170-21；C.16M-170-22；D.16M-171-26。

圖5 16M-170-21在現(xiàn)蕾期、抽薹期和開花期的性狀Fig.5 Characteristics of 16M-170-21 at budding，bolting and flowering stage

2.3 紫色F1的自交、回交一代BC1F1植物學(xué)性狀

2017年4月，重點(diǎn)調(diào)查了F116M-170-21的自交后代以及回交一代BC1F1(16M-170-22×15綠1-1-26)的性狀。結(jié)果表明：16M-170-21自交后代表現(xiàn)出多種類型，其中8株的主要性狀為：芥菜型，葉片顏色深紫色，圓形葉，葉緣鋸齒，深淺不等，葉柄窄、細(xì)長，無葉翼；另外7株的主要性狀為：白菜型，葉片顏色深紫色，圓形葉，葉柄長，有葉翼(圖6)。31株BC1F1性狀全部表現(xiàn)為白菜類型，其中14株葉片為紫色，17株葉片為綠色。10株BC1F1后代性狀見圖7。2017年5月8日，調(diào)查BC1F1紫色植株自交結(jié)實(shí)情況，結(jié)果表明：14株紫色植株結(jié)實(shí)性很好。

圖6 16M-170-21自交后代性狀Fig.6 Characteristics of self-inbred plants of 16M-170-21

2.4 葉片中花青素的分布情況

在顯微鏡下觀察葉片花青素的分布情況，結(jié)果表明：F1紫色大白菜16M-170-22的花青素主要分布在葉片的上表皮和下表皮，下表皮少于上表皮，而在綠色大白菜16-1081的上、下表皮中均沒有觀察到花青素(圖8)。

A.紫色株；B.綠色株。A.Purple plants；B.Green plants.

A.16-1081；B.16M-170-22。

2.5 植株的倍性分析

2.5.1 紫色F1的倍性 經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，二倍體白菜2n熒光強(qiáng)度高峰位于48(圖9-A)，異源四倍體芥菜4n熒光強(qiáng)度高峰位于96(圖9-B)。在F1紫色植株中，16M-170-21熒光強(qiáng)度高峰位于105，倍性為4n(圖10-A)，16M-170-22熒光強(qiáng)度高峰位于80(圖10-B)，推測為3n，即2n+n，16M-171-24熒光強(qiáng)度高峰位于150，倍性為6n(圖10-C)，16M-171-26熒光強(qiáng)度高峰位于70(圖10-D)，推測為3n，即2n+n。

2.5.2 綠色F1的倍性 與紫色F1植株一樣，綠色F1植株也存在復(fù)雜的倍性變化。圖11顯示為四倍體和混倍體。

2.6 染色體數(shù)分析

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，在F1紫色大白菜中，16M-170-21染色體數(shù)為36條(圖12)，基因型可能為芥菜型AABB，即IIA+IIB；16M-170-22染色體數(shù)為28條(圖13)，基因型可能為AAB，即IIA+IB；16M-171-24染色體數(shù)為24條(圖14)，基因型可能為ABB，即IIB+IA；16M-171-26染色體為28條(圖15)，基因型可能為AAB，即IIA+IB。

A.白菜二倍體；B.芥菜異源四倍體。A.B.rapa diploid；B.B.juncea heterotetraploid.

A.16M-170-21；B.16M-170-22；C.16M-171-24；D.16M-171-26。

A.四倍體F1植株；B.混倍體(二倍與四倍F1植株)。A.4n；B.Mix-ploid (2n and 4n).

圖12 16M-170-21染色體(4n=36，100×)Fig.12 Chromosome of 16M-170-21(4n=36，100×)

圖13 16M-170-22染色體(3n=28，100×)Fig.13 Chromosome of 16M-170-22(3n=28，100×)

圖14 16M-171-24染色體(3n=24，100×)Fig.14 Chromosome of 16M-171-24(3n=24，100×)

圖15 16M-171-26染色體(3n=28，100×)Fig.15 Chromosome of 16M-171-26(3n=28，100×)

2.7 轉(zhuǎn)錄組測序分析

F1紫色植株16M-170-22、BC1F1紫色植株17M-245-21和17M-247-22、F1綠色植株16M-170-23的植物學(xué)性狀特征見圖16。利用Illumina HiSeqTM 4000，對紫色單株BCZ(16M-170-22、17M-245-21、17M-247-22)和綠色單株BCL(16M-170-23)進(jìn)行初步的轉(zhuǎn)錄組測序分析。將原始序列數(shù)據(jù)(Raw data)進(jìn)行過濾處理，去除接頭污染Reads、低質(zhì)量Reads和含N比例大于5%的Reads，最后得到Clean data。

使用比對軟件Tophat(http：//ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)，將每個樣品的Clean data與白菜參考基因組(http：//brassicadb.org/brad/)進(jìn)行比對。由表3可見，紫色單株BCZ的定位總個數(shù)百分比、雙末端定位個數(shù)百分比、左端定位個數(shù)百分比、右端定位個數(shù)百分比均低于綠色單株BCL，體現(xiàn)了紫色單株BCZ基因組的復(fù)雜性，進(jìn)一步證明15NG28的紫色性狀可能并非來源于大白菜的事實(shí)。

以紫色單株BCZ為參考，經(jīng)進(jìn)一步比較紫色單株16M-170-22、17M-245-21、17M-247-22和綠色單株16M-170-23差異表達(dá)基因的表達(dá)量FPKM，并篩除假陽性，結(jié)果表明：明顯上調(diào)的基因共有140個，明顯下調(diào)的基因共有16個。在差異表達(dá)基因分析結(jié)果中，選取參與黃酮類合成代謝通路的相關(guān)基因，如在紫色單株明顯上調(diào)表達(dá)的15個差異表達(dá)基因，進(jìn)行聚類分析(圖17)。

A.16M-170-22；B.16M-170-23；C.17M-245-21；D.17M-247-22。

樣品Samples讀碼總數(shù)Totalreads定位總個數(shù)百分比/%Percentoftotalmappedreads雙末端定位個數(shù)百分比/%Percentofmappedpairreads左端定位個數(shù)(百分比)Percentofmappedleftreads右端定位個數(shù)(百分比)PercentofmappedrightreadsBCL4787061484.975.920554669(85.9%)20066163(83.8%)BCZ4659573873.564.417337028(74.4%)16929714(72.7%)

每行代表一個基因，不同顏色代表基因的表達(dá)變化倍數(shù)或表達(dá)量。對于差異表達(dá)基因聚類：淺顏色表示表達(dá)量上調(diào)，深顏色表示表達(dá)量下調(diào)。對于樣品聚類：黑色到白色表示表達(dá)量從小到大，顏色越淺表示差異表達(dá)基因的表達(dá)量越高。

Each row presented one gene，and different colors meant expression amount or expression level.For differentially expressed genes in each row，light color meant up-regulation and dark color meant down-regulation.For clustering chart in each column，colors from dark to light meant low to high gene expression level.

圖1715個差異表達(dá)基因聚類模式圖
Fig.17Clusteringchartoffifteendifferentiallyexpressedgenes

進(jìn)一步對紫色單株和綠色單株差異表達(dá)基因的GO功能注釋進(jìn)行分類作圖，結(jié)果表明：3種GO功能注釋分別描述為基因的分子功能(Molecular function)、細(xì)胞成分(Cellular component)和參與的生物過程(Biological process)(圖18)。圖18解釋了在差異基因背景和全部基因背景下，GO各二級功能的18個生物過程、10個細(xì)胞成分和7個分子功能差異基因富集情況，體現(xiàn)了具有明顯比例差異的二級功能差異基因富集與全部基因富集的不同趨勢。

同時，對紫色單株BCZ中參與花青素合成相關(guān)代謝通路及其基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)參與類黃酮、黃酮和黃酮醇、花青素生物合成等3個代謝通路相關(guān)的差異表達(dá)基因共12個：7個類黃酮生物合成途徑基因生物，4個黃酮和黃酮醇生物合成途徑基因，1個花青素合成途徑基因(表4)。另外，12個差異表達(dá)基因在紫色材料BCZ中差異表達(dá)量最高的2個基因均為結(jié)構(gòu)基因：Bra013652(AT4G22880)為無色花青素雙加氧酶(LDOX)，Bra027457(AT5G42800)為二氫黃酮醇還原酶(DFR)。12個差異表達(dá)基因在白菜和擬南芥中比較和功能見表5，將是今后的重點(diǎn)研究內(nèi)容。

3 討論與結(jié)論

有關(guān)大白菜紫色資源的創(chuàng)制以及與花青苷合成相關(guān)的基因表達(dá)、克隆等內(nèi)容是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，如紫色大白菜[13-19]、紫色小白菜[20-22]、紫色菜薹[22]等。

目前，國內(nèi)普遍利用紫色小白菜與大白菜雜交，獲得葉片紫色的大白菜材料，育成紫色白菜品種，如京研紫快菜等，但是該紫色性狀僅在葉片正面表現(xiàn)出深紫色，而子葉、真葉和心葉的背面均為綠色，尤其是葉球剖面呈現(xiàn)出紫色、白色、黃色等多種顏色，即紫色表現(xiàn)不均勻，因此，該材料在大白菜育種中存在一定的局限性，該紫色品種的推廣也受到一定限制[3-4]。西北農(nóng)林科技大學(xué)選育出高花青素含量大白菜純系11S91，該紫色性狀來源于紫色菜薹，但其外葉、葉柄和葉脈均為綠色，只有葉球剖面的心葉部分表現(xiàn)為紫色，花青素主要分布在葉片表皮下2～3層細(xì)胞[15，19]。紫色性狀表現(xiàn)優(yōu)異的大白菜資源主要有2種：紫紅色大白菜新種質(zhì)B90335-5[2，10-11]和紫色大白菜品種，如紫寶、紫裔。研究表明，紫紅色大白菜B90335-5紫紅色性狀不符合孟德爾遺傳規(guī)律[10]。當(dāng)前國內(nèi)還沒有育成類似于紫寶的紫色大白菜品種，因此，大白菜紫色資源的原創(chuàng)工作非常迫切和重要。喬海云等[23]獲得了大白菜與紫色甘藍(lán)的種間雜種。15NG28與大白菜雜交F1、回交BC1F1的紫色植株性狀不僅葉片正反面、葉脈全部為紫色，而且葉柄正反面也為紫色，與紫紅色芥菜、紫寶的紫色性狀較一致，與來源于紫色小白菜、紫色菜薹的紫色性狀明顯不同。初步認(rèn)為，新型紫色材料15NG28的紫色性狀可能來源于紫色芥菜。同時，僅用常規(guī)方法，15NG28可以成功與白菜進(jìn)行雜交、回交，轉(zhuǎn)育紫色性狀，且后代較容易獲得種子。雖然雜交F1、BC1F1后代的倍性、染色體行為存在復(fù)雜性，這也說明芥菜的紫色性狀整合到白菜基因組是一個復(fù)雜的、漫長的生物學(xué)過程，但是可喜的是，本研究僅在31株BC1F1(16M-170-22×15綠1-1-26)后代中就發(fā)現(xiàn)了14個紫色植株，而且全部植株均為白菜，結(jié)實(shí)性好，植物學(xué)性狀、染色體數(shù)目等都具有白菜基因組AA的特征特性。下一步，筆者將利用2株BC1F1(17M-245-21、17M-247-22)分別與綠色大白菜骨干親本系雜交，繼續(xù)轉(zhuǎn)育紫色性狀，創(chuàng)制大白菜骨干親本系的紫色資源，為選育出紫色大白菜新品種奠定基礎(chǔ)。因此，15NG28、雜交F1，尤其是BC1F1后代中的紫色植株具有潛在的應(yīng)用價值。

橫坐標(biāo)為GO 各分類內(nèi)容，縱坐標(biāo)左側(cè)為基因數(shù)目所占百分比，右側(cè)為基因數(shù)目。矩形直方圖代表上調(diào)基因，橢圓圖代表下調(diào)基因。

通路Pathway注釋通路的DEG基因DEGswithannotationpathway(107)注釋通路的全部注釋基因Allgeneswithannotationpathway(22358)P值PvalueQ值Qvalue通路路徑PathwayID差異表達(dá)的基因Differentiallyexpressedgenes類黃酮生物合成Flavonoidbiosynthesis7(6.54%)285(1.27%)0.00044723050.013864146ko00941Bra027457、Bra030550、Bra013652、Bra036208、Bra019350、Bra007142、Bra009312黃酮和黃酮醇生物合成Flavoneandflavonolbiosynthesis4(3.74%)127(0.57%)0.0032644060.050598293ko00944Bra034677、Bra009312、Bra008316、Bra035271花青素生物合成Anthocyaninbiosynthesis1(0.93%)13(0.06%)0.060475140.288419898ko00942Bra038445

表5 白菜差異表達(dá)基因在擬南芥中名稱和功能注釋Tab.5 Names and annotations of differentially expressed genes in B.rapa and A.thaliana

蕓薹屬禹氏三角(U′s triangle)包括3個二倍體基本種：白菜AA(B.rapa，2n = 20)、甘藍(lán)CC(B.oleracea，2n = 18)、黑芥BB(B.nigra，2n = 16)和3個四倍體復(fù)合種：甘藍(lán)型油菜AACC(B.napus，2n=38)、芥菜型油菜AABB(B.juncea，2n=36)和埃塞俄比亞芥BBCC(B.carinata，2n=34)。測序結(jié)果表明，白菜基因組大小為485 Mb，黑芥基因組大小為591 Mb，甘藍(lán)基因組大小為630 Mb，而芥菜基因組大小為922 Mb。本研究中，以觀察15NG28、雜交F1、回交BC1F1后代的倍性和染色體數(shù)目為輔助手段，重點(diǎn)選擇具有更多AA基因組特征的后代進(jìn)行人工自交、回交授粉，以減少工作量，進(jìn)而快速獲得具有大白菜性狀的紫色中間材料，如17M-245-21、17M-247-22等。在試驗(yàn)中，流式細(xì)胞儀峰值的位置一方面受植物染色體組成決定，另一方面還有2.5%～5.0%的系統(tǒng)誤差。通過流式細(xì)胞儀，很難確定某個材料的基因組組成。下一步，將利用黑芥的特異標(biāo)記等，輔助篩選具有芥菜紫色性狀的大白菜中間材料。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，16M-171-24染色體數(shù)為24條，可能為三倍體，但流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果為六倍體，二者結(jié)果不同，可能原因是16M-171-24同株上同時出現(xiàn)了三倍體和六倍體的枝條，而筆者選取了三倍體花蕾觀察染色體數(shù)目。在白菜和芥藍(lán)等蕓薹屬小孢子培養(yǎng)過程中，經(jīng)?？梢园l(fā)現(xiàn)在同一DH植株上生長不同倍性枝條的情況。同樣，即使經(jīng)過多次人工自交和與白菜回交，仍沒能獲得16M-171-24自交種子以及回交后代種子，說明16M-171-24具有復(fù)雜的染色體和基因組。

目前，有關(guān)大白菜花青苷結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子等有關(guān)研究已見報(bào)道。Xie等[11]對紫紅色和綠色大白菜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，共獲得可定位在白菜參考基因組上的差異表達(dá)基因(DEGs)930個，其中389個基因上調(diào)表達(dá)，541個基因下調(diào)表達(dá)。通過進(jìn)一步重新組裝未定位的reads，又發(fā)現(xiàn)了2 031個Unigenes。作者認(rèn)為芥菜的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子c3563g1i2被導(dǎo)入到大白菜基因組中，可能參與大白菜花青素合成。本研究對F1的1個綠色植株16M-170-23、1個紫色植株16M-170-22和BC1F1的2個紫色植株17M-245-21、17M-247-22分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明：在紫色材料中差異表達(dá)量最高的2個基因均為結(jié)構(gòu)基因：Bra013652(LDOX)，Bra027457(DFR)，該結(jié)論與Xie等[11]報(bào)道控制紫紅色大白菜的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子c3563g1i2完全不同，但與Xie在比對花青素合成途徑的轉(zhuǎn)錄子后發(fā)現(xiàn)花青素合成途徑中Bra013652和Bra027457基因的上調(diào)表達(dá)量最高及這2個基因的Log2FC值10.05和10.07也最高的結(jié)論相吻合。由此可見，15NG28及其雜交、回交后代可能為新的大白菜紫色資源材料。

2017年秋季，將進(jìn)一步調(diào)查14株BC1F1紫色白菜的自交后代和回交二代BC2F1的植物學(xué)性狀和葉片顏色分離情況，重點(diǎn)研究17M-245-21和17M-247-22的自交后代和BC2F1后代的性狀，以期獲得一批紫色大白菜中間材料，再通過人工加代等多代自交和游離小孢子技術(shù)獲得紫色大白菜的純合系和DH系，最后配制紫色與綠色的F1，構(gòu)建葉片顏色分離群體，如F2和DH群體，進(jìn)一步開展紫色性狀的遺傳規(guī)律、染色體定位等相關(guān)研究。同時，將利用實(shí)時定量熒光PCR(qRT-PCR)技術(shù)，對12個差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步研究控制15NG28紫色性狀花青素合成途徑的相關(guān)基因。

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