徐 敏，王 威，姜方旭，喬 虹，張 玲

(1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 內分泌與代謝病科， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.西澳大學Harry Perkins醫(yī)學研究院， 尼德蘭茲 WA6009； 3.鄭州市第三人民醫(yī)院 內分泌科,河南 鄭州 450000)

研究論文

肥胖抑制素減輕高糖致大鼠INS1細胞的凋亡

徐 敏1,3，王 威1*，姜方旭2，喬 虹1，張 玲1

(1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 內分泌與代謝病科， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.西澳大學Harry Perkins醫(yī)學研究院， 尼德蘭茲 WA6009； 3.鄭州市第三人民醫(yī)院 內分泌科,河南 鄭州 450000)

目的探討肥胖抑制素(OB)減輕高糖致大鼠胰島細胞系INS1細胞的凋亡作用。方法INS1細胞在不同糖濃度環(huán)境下培養(yǎng)24 h，用MTT法檢測INS1細胞存活率和增殖；Hoechst33258細胞核染色法檢測細胞核形態(tài)學；酶標法檢測caspase- 3活性及OB的保護作用是否涉及了PI3K；real-time PCR檢測FOXO1、SREBP1c、Bax和PDX- 1 mRNA的表達。結果在高糖條件下，OB促進INS1細胞的增殖，在100 nmol/L濃度時能最大程度促進INS1細胞增殖(與對照組、高糖組相比，P<0.01)。OB能減輕高糖誘導的凋亡(P<0.01)；在高糖組，F(xiàn)OXO1、SREBP1c和Bax基因表達較對照組增多，PDX- 1表達減少；反之在OB干預的高糖組；FOXO1、SREBP1c和Bax表達減少，PDX- 1表達增多。結論OB能夠減輕高糖致大鼠INS1細胞的損傷作用。

肥胖抑制素；糖毒性；INS1細胞；保護作用

2型糖尿病(type 2 mellitus diabetes，T2DM)在全世界發(fā)病率不斷增加，成為一個威脅健康的主要問題[1]。持續(xù)的高血糖癥能夠引起氧化應激、ER應激和缺氧應激等，從而導致胰島β細胞數(shù)量及功能下降，最終形成2型糖尿病[2]。肥胖抑制素(obestatin,OB)是2005年在生物信息學搜索的基礎上發(fā)現(xiàn)，它是由23個氨基酸組成，C末端甘氨酸殘基帶有?；揎椈?，并且由prepro-ghrelin編碼(ghrelin前體)[3]。Obestatin這一術語起源于拉丁語“obedere”,意為“吞食”,OB意為肥胖抑制素。OB的生理作用最初被認為與胃饑餓素(ghrelin)相反，能夠抑制食欲或者促進生長激素(GH)的分泌[3]。OB能通過影響糖、脂代謝阻止糖尿病的發(fā)生[4]。但是OB的受體仍存在爭議。有研究顯示，人的胰島細胞及β細胞系在炎性反應因子作用條件下，OB能夠使PI3K/Akt、ERK1/2及cAMP磷酸化，并能夠促進胰島素分泌及相關基因表達，從而對胰島β細胞發(fā)揮保護作用[5]。在2型糖尿病患者的胰島中發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA水平是增加的[6]。FOXO1是PI3K/Akt信號路徑的下游因子。那么，OB在糖毒性條件下，能否對胰島β細胞發(fā)揮保護作用？這點仍然不清楚。本研究，證實了在糖毒性條件下，OB對β細胞的保護作用涉及了PI3K信號通路、FOXO1因子、ER應激、線粒體功能及胰島素信號相關通路。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠INS1胰島細胞系(美國康奈爾大學)；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清和0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco公司)；青鏈霉素(碧云天公司)；D-glucose、噻唑藍(MTT)(Sigma公司)；OB(Phenix公司)；細胞凋亡熒光Hoechst33258試劑盒(北京索萊寶公司)；Trizol、RT-PCR引物(Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒(Roche公司)；

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與分組：將INS1細胞在37 ℃水浴箱中快速復蘇，培養(yǎng)基重懸將細胞混懸液立即放入已經(jīng)準備好的裝有10% FBS RPMI- 1640培養(yǎng)液的離心管中，離心5 min，取出倒掉上清，加入10% FBS RPMI- 1640培養(yǎng)液4 mL，把細胞吹打混勻，移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，待增殖至瓶壁75%時即可傳代。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖測定：將INS1細胞分為對照組(11.1 mmol/L)和高糖組(55.5 mmol/L)在1640培養(yǎng)基中，加或不加OB(濃度為1、10、100和500 nmol/L)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)后放入5% CO237 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行孵育，4 h后終止孵育，小心棄去上清，注意盡量避免吸取紫色結晶(formazan,甲瓚)，加入DMSO 150 μL/孔，放入空氣搖床中，搖晃10 min，使DMSO與甲瓚充分融合。然后將96孔板放入酶聯(lián)免疫檢測儀中，波長調至570 nm，開始檢測每個孔的A值。

1.2.3 Hoechst33258細胞核染色：使用6孔板，在孔板中放入已經(jīng)高壓、滅菌的蓋玻片，放入細胞對照組和高糖組的懸液，待細胞爬片。之后棄去上清，分為對照組及高糖組放入5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察，INS- 1細胞增殖至覆蓋底部面積的約50%～80%，吸去上清，加入固定液0.5 mL，固定10 min。之后吸去固定液，使用PBS洗2遍，每次3 min，盡量吸凈液體。在載玻片上滴上1滴抗熒光衰減劑，小心蓋上有細胞的蓋玻片，讓細胞小心接觸封片液，避免產(chǎn)生氣泡。使用熒光顯微鏡觀察，調整最大激發(fā)波長為352 nm，最大發(fā)射波長為461 nm。對照組細胞核為藍色橢圓形，高糖組細胞核出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象。

1.2.4 酶標法caspase- 3活性檢測：參照caspase- 3細胞活性檢測試劑盒進行檢測。在對照組及高糖組加或不加obestatin(100 nmol/L)以及PI3K阻斷劑LY294002(LY)干預24 h，后開始收集細胞，按照每200萬個細胞加入細胞裂解液的比例進行細胞裂解，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000～20 000×g離心15 min，把上清移入預冷的離心管，立即測定caspase- 3細胞活性。

1.2.5 Real-time PCR測定FOXO1、Bax、SREBP1c、PDX1 mRNA的表達情況：分組干預后收集細胞離心，按照Trizol試劑說明書提取RNA，測取濃度并反轉錄成cDNA，應用SYBR Green熒光染料法進行real-time PCR測定。各引物序列：β-action：5′-CCTG TGGCATCCATGAAACTAC-3′(上游)，5′-CCAGGG CAGTAATCTCCTTCTG-3′ (下游)；FOXO1：5′-ACA CCATGCCTCACACATCTG-3′ (上游)，5′-GGAGGAC ACCCATCCTACCA-3′(下游)；Bax:5′-AGCGAGT GTCTCAGGCGAAT-3′ (上游) 5′-CCGGCCCCAGTT GAAGTT-3′(下游)；SREBP1c：5′-GCCCAGGTGACC CGACTATT-3′ (上游)，5′-GACAGCGTCAGAACAG CTATTTAGC-3′ (下游)；PDX1：5′-GAGCTGGCAGT GATGATGCTCAA-3′ (上游)，5′-ACAATCCTGCTC CGGCTCTT-3′ (下游)?；虮磉_量使用2-△△Ct相對定量法計算。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 在高糖毒性條件下， OB能促進細胞INS1的增殖

高糖組的增殖率低于對照組(P<0.01)。在對照組和高糖組，OB在100 nmol/L時能夠達到最大增值率，與對照組相比增值率達137%(P<0.01)，與高糖組相比增值率達37%(P<0.01)。無論是在對照組還是高糖組OB濃度至少在10 nmol/L時才能促進β細胞增殖(圖1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control；#P<0.05，##P<0.01 compared with high glucose圖1 在高糖條件下，OB促進INS1細胞的增殖Fig 1 OB promotes INS1 cells proliferation under glucotoxicity state(±s, n=5)

2.2 在糖濃度為55.5mmol/L條件下， INS1細胞核出現(xiàn)固縮和碎裂

在對照組可見到細胞核呈藍色橢圓形，高糖組中可見到細胞核出現(xiàn)固縮、碎裂(圖2)。

圖2 高糖濃度對INS1細胞核的影響Fig 2 Effect of glucose with higher concentrations on INS1 nucleus morphology were detected by Hoechst33258(original magnification ×400)

2.3 OB保護β細胞拮抗高糖誘導凋亡，涉及了PI3K信號通路

胰島β細胞在對照組和高糖組加或不加PI3K阻斷劑LY294002(LY)和OB，OB的濃度為100 nmol/L，LY的濃度為50 μmol/L。對照組+ LY組caspase- 3活性和對照組相比顯著增高(P<0.05)，對照組+OB組caspase- 3活性和對照組相比顯著降低達36%(P<0.01)，對照組+OB+LY組caspase- 3活性和對照組+OB組相比顯著升高達31%(P<0.05)，對照組+OB+LY組caspase- 3活性和對照組+LY組相比降低達32%(P<0.01)。高糖組caspase- 3活性明顯升高與對照組相比(P<0.01)，高糖組+OB組caspase- 3活性和高糖組相比顯著降低達43%(P<0.01)。高糖組+OB+LY組caspase- 3活性和高糖組+OB組相比顯著升高達57%(P<0.05)，高糖組+OB+ LY組caspase- 3活性和高糖組+LY組相比顯著降低達36%(P<0.01)(圖3)。

2.4 OB涉及了 FOXO1、線粒體、內質網(wǎng)及胰島素相關通路

1)高糖組與對照組比較FOXO1基因表達明顯增多(P<0.05)；對照組+OB組與對照組比較FOXO1基因表達明顯減少(P<0.01)；高糖組+OB組與高糖組比較，F(xiàn)OXO1基因表達明顯減少(P<0.01)。2)高糖組與對照組比較Bax基因表達明顯增多(P<0.01)；對照組+OB組與對照組比較Bax基因表達明顯減少(P<0.01)；高糖組+OB組與高糖組比較，Bax基因表達明顯減少(P<0.05)。3)高糖組與對照組比較SREBP1c基因表達明顯增多(P<0.01)；高糖組+OB組與高糖組比較，SREBP1c基因表達明顯減少(P<0.05)。4)對照組與高糖組比較PDX1基因表達明顯減少，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；對照組與對照組+OB組比較PDX1基因表達增多(P<0.05)；高糖組與高糖組+OB組比較，PDX1基因表達明顯減少(P<0.05)； 糖濃度為高糖組+OB組與高糖組比較， PDX1基因表達明顯減少(P<0.01)(圖4)。

*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 圖3 在高糖條件下，OB能夠影響INS1細胞caspase- 3活性并且這與PI3K通路相關Fig 3 Under high glucose state,the effect of OB on caspase- 3 activity of INS1 pancreatic β-cells and its association with PI3K path way

3 討論

OB是最近新發(fā)現(xiàn)的一種激素，是由ghrelin前體(prepro-ghrelin)基因編碼，能夠促進β細胞和人的胰島細胞存活，促進胰島素分泌，但是其具體的分子機制仍然不是很明確[5]。OB是否保護2型糖尿病患者中處于高糖環(huán)境的胰島β細胞仍有待確定。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在高糖條件下OB能促進β細胞的增殖；OB能抑制高糖條件下誘導的凋亡，這與PI3K通路相關；其保護作用涉及ER應激、線粒體、胰島素信號通路以及FOXO1因子。

高糖能夠刺激胰島β細胞氧化應激、ER應激、缺氧應激以及誘導炎性反應因子水平增加，使胰島β細胞發(fā)生凋亡、自噬、去分化以及增值降低，最終引起β細胞數(shù)量及功能障礙[6- 8]，最終形成2型糖尿病。有研究顯示OB在炎性反應介質環(huán)境下，能夠磷酸化PI3K、ERK1/2、CAMP和IRS2信號路徑，從而保護大鼠胰島β細胞以及人的胰島細胞[5]。但是目前還沒有研究證明，在高糖條件下OB對胰島β細胞發(fā)揮保護作用機制。PI3K通路與胰島細胞增殖和胰島素分泌關系非常密切， FOXO1是PI3K信號路徑的下游因子[9- 11]。 有研究證明， 在一項關于人的研究中證明了在2型糖尿病患者的胰島中發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA水平是增加的[12]。此次研究，證明了在高糖條件下，OB能夠促進胰島細胞增殖；OB能抑制高糖誘導的凋亡，這與PI3K通路相關；OB對胰島β細胞的保護作用涉及了FOXO1因子、ER應激、線粒體及胰島素相關通路。

A.FOXO1 gene expression; B.Bax gene expression; C.SREBP1c gene expression; D.PDX- 1 gene expression;*P<0.05，**P<0.01 compared with control；#P<0.05，##P<0.01 compared with high glucose

本次實驗證明了在高糖條件下能夠最大抑制胰島β細胞的活性達24%，在形態(tài)學證實了高糖能夠使細胞核發(fā)生變化，核固縮和核碎裂(圖3)。有報道證實，OB在100 nmol/L時能夠對胰島細胞產(chǎn)生最大的促增殖作用[5]。這次研究也證實了這個結論，OB濃度為100 nmol/L時能夠對胰島細胞產(chǎn)生最大的促增殖作用，OB起保護作用的濃度至少是10 nmol/L。OB在500 nmol/L的濃度增值率與濃度100 nmol/L OB相比稍下降，可能與受體飽和有關。

caspase- 3是凋亡的標志物，為了進一步探討OB在高糖條件下能否拮抗INS1細胞的凋亡，在對照組和高糖組分別加入濃度為100 nmol/L的OB，發(fā)現(xiàn)加入OB后caspase- 3活性明顯下降，認為OB能夠拮抗高糖誘導的細胞凋亡。為了進一步證實OB能夠拮抗高糖誘導的細胞凋亡是否與PI3K通路相關，加入了PI3K通路阻斷劑LY294002，通過caspase- 3的變化證實了OB保護β細胞拮抗高糖誘導的凋亡，這與PI3K信號通路相關。這次實驗也證明了OB不能夠完全拮抗高糖引起的凋亡，暗示了存在其他通路參與了這個過程。

高血糖能夠誘導氧化應激、ER應激、缺氧應激以及誘導炎性反應因子的水平增加[13]。為了進一步探索OB對胰島β細胞的保護作用是否涉及了FOXO1因子、ER應激、線粒體及胰島素相關通路。在高糖組FOXO1 mRNA表達的量與對照組相比明顯增加，這點與在一項關于人的研究中證明了在2型糖尿病患者的胰島中發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA水平是增加的[14]相一致。促凋亡基因BCL2家族成員基因Bax基因，這個基因與線粒體相關，在高糖組也出現(xiàn)類似的結果，加入OB后FOXO1和Bax表達明顯下降，認為OB拮抗高糖組保護β細胞涉及了FOXO1因子和線粒體通路。SREBP1c是轉錄因子固醇調節(jié)原件結合蛋白- 1C，是一個轉錄因子，是在內質網(wǎng)膜合成，CHOP- 10是促凋亡CCAAT/增強結合蛋白(C/EBP),也被稱作GADD153，它是C/EBP家族的轉錄因子[15]，這兩者都是公認的ER應激標志物。在高糖條件下，內質網(wǎng)應激標志物CHOP- 10和SREBP1c與對照組相比表達增多，加入OB后CHOP- 10、SREBP1c表達明顯降低，認為OB拮抗高糖保護β細胞涉及了內質網(wǎng)相關路徑。在高糖條件下OB保護β細胞與CHOP- 10下調有關。PDX- 1是一個控制β細胞增殖和胰島素分泌功能的關鍵轉錄因子，具有促進胰島素的合成和分泌作用，INS1是胰島素相關基因。本次實驗結果也表現(xiàn)出在高糖組PDX- 1和INS1表達是降低的，加入OB后PDX- 1和INS1表達是增高的，由此推測OB對胰島細胞的保護作用涉及了胰島素信號通路。

總之，在高糖條件下，OB對胰島細胞的保護作用涉及FOXO1因子、ER應激、線粒體路徑和島素信號通路。雖然目前對于OB作用的受體不明確，但是OB對于胰島β細胞的保護作用將會成為對于糖尿病治療的一個新策略。

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Obestatin attenuates apoptosis induced by high glucose in INS1 cells

XU Min1,3, WANG Wei1*, JIANG Fang-xu2, QIAO Hong1, ZHANG Ling1

(1.Dept. of Endocrinology and Metabolism， the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086,China;2.Harry Perkins Institute of Medical Research, University of Western Australia, Nedlands WA 6009, Australia;3.Dept. of Endocriology, the Third People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of obestatin on the apoptosis of rat pancreatic islet cell line INS1 induced by high glucose.MethodsINS1 cells were cultured in different concentrations of glucose.The survival rate and proliferation of INS1 cells were detected by MTT method;Hoechst33258 nuclear staining was used to detect nuclear morphology. caspase- 3 method was used to study the relationship between the protective effect of obestatin and the PI3K pathway; Finally，using real-time PCR detection ofFOXO1 andSREBP1c,Bax,PDX- 1 expression, to further clarify the protective effect of obestatin on cells.ResultsIn high glucose condition,obestatin promoted the proliferation of INS1 cells at 100 nmol/L,and promoted the proliferation of INS1 cells significantly(P<0.01, compared with the control group and high glucose group).Obestatin can reduce high glucose-induced apoptosis(P<0.01).The expressions ofFOXO1,SREBP1c,BaxandPDX- 1 decreased,while the expression ofFOXO1,SREBP1c,BaxandPDX- 1 increased in high glucose group.ConclusionsOB can attenuate the injury of INS1 cells induced by high glucose in rats.

obestatin; glucotoxicity;INS1 cells; protection

2016- 06- 16

2017- 02- 09

國家自然科學基金(81471081);黑龍江省自然科學基金(H201416);黑龍江省教育廳科學技術研究項目(11551199);哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院博士基金(BS2011- 12)

*通信作者(correspondingauthor)：wwei19742007@hotmail.com

1001-6325(2018)01-0007-06

IQ291

A