劉海宏，石剛，張睿

[1.東北大學(xué)醫(yī)院 外科，遼寧 沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院（遼寧省腫瘤醫(yī)院），結(jié)直腸外科，遼寧 沈陽 110042]

結(jié)腸癌組織中ERRα和ERRβ的表達水平及其臨床意義*

劉海宏1，石剛2，張睿2

[1.東北大學(xué)醫(yī)院 外科，遼寧 沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院（遼寧省腫瘤醫(yī)院），結(jié)直腸外科，遼寧 沈陽 110042]

目的檢測結(jié)腸癌組織中雌激素相關(guān)受體α（ERRα）和ERRβ的表達水平，分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，并探討其臨床意義。方法選取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本各63例，采用免疫組織化學(xué)法檢測ERRα和ERRβ蛋白陽性表達，觀察其與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，探討兩者相關(guān)性。結(jié)果ERRα和ERRβ蛋白表達于結(jié)腸癌及癌旁組織細胞核，在癌組織中高表達，癌旁組織中弱表達，結(jié)腸癌組織中ERRα和ERRβ蛋白的陽性表達率高于癌旁組織（P＜0.05）。ERRα和ERRβ蛋白的陽性表達與腫瘤浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度有關(guān)（P＜0.05）。Spearman rank相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中ERRα與ERRβ蛋白的陽性表達率呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論ERRα和ERRβ在結(jié)腸癌組織中高表達，與結(jié)腸癌不良預(yù)后臨床病理特征具有相關(guān)性，兩者可能共同調(diào)控結(jié)腸癌的惡性行為。

結(jié)腸癌；ERRα；ERRβ

結(jié)直腸癌在發(fā)達國家和發(fā)展中國家呈發(fā)病率逐年上升的趨勢，是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。在我國，結(jié)腸癌占惡性腫瘤第3位，死亡率占惡性腫瘤第2位。結(jié)直腸癌從正常上皮到惡變需經(jīng)歷不典型增生、腺瘤、原位癌及進展期癌等階段[2]。不同階段均有特異性分子事件發(fā)生，是多基因參與的過程。對腫瘤發(fā)生相關(guān)基因及因子分子的深入研究是未來結(jié)直腸癌預(yù)防和治療重要的理論依據(jù)[3]。雌激素相關(guān)受體（estrogen receptor related receptor，ERR） 由α、β、γ 3種亞型組成[4]。有研究顯示，ERR在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食管癌及乳腺癌中高表達，是預(yù)后差的標(biāo)志物[5]。本研究對結(jié)腸癌組織中ERRα和ERRβ的表達水平進行檢測，分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，為進一步研究ERRα和ERRβ在結(jié)腸癌惡性行為中的作用建立實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

選取2014年1月-2015年12月在東北大學(xué)醫(yī)院外科和中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科行手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者63例，分別取癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本石蠟包埋。ERRα多克隆抗體、ERRβ多克隆抗體及免疫組織化學(xué)SP法試劑盒購自美國Santa Cruz公司。

1.2 免疫組織化學(xué)法

采用免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸癌及癌旁組織中ERRα和ERRβ蛋白的表達。將石蠟按4μm厚度進行切片，60℃烤箱內(nèi)烘烤2 h后依次脫水、脫蠟及抗原修復(fù)，3%雙氧水H2O250 ml洗滌后于37℃烤箱烘干25 min，采用PBS洗滌3次。加入1∶500稀釋倍數(shù)的一抗，置入濕盒中4℃孵育過夜。室溫復(fù)溫20 min后PBS洗滌3次，加二抗37℃下孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木素復(fù)染10 min、流水洗凈，鹽酸酒精進行20 s分化，再次洗滌30 min，脫水透明，應(yīng)用二甲苯中性樹膠進行封片。采用已知小腸組織中ERRα和ERRβ蛋白陽性表達為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。由2位高年資病理醫(yī)師用雙盲法進行評估結(jié)果。在400倍顯微鏡下，每張切片隨機選取5個視野，每視野上計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分比。陽性細胞百分比＜10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分；染色強度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐或棕褐色為3分；兩者相加＞2分為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，ERRα與ERRβ的相關(guān)性分析用Spearma rank法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERRα和ERRβ蛋白的表達

ERRα和ERRβ蛋白表達于結(jié)腸癌及癌旁組織細胞核，在癌組織中表達較強，癌旁組織中表達較弱（見附圖）。結(jié)腸癌組織中ERRα和ERRβ蛋白陽性表達率與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)腸癌組織高于癌旁組織（見表1）。

附圖 ERRα和ERRβ蛋白的表達 （免疫組織化學(xué)法×400）

表1 結(jié)腸癌及癌旁組織中ERRα、ERRβ蛋白陽性表達率比較 [n =63，例（%）]

2.2 ERRα、ERRβ蛋白陽性表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中ERRα、ERRβ蛋白陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型、病理類型無關(guān)，而與腫瘤浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 ERRα、ERRβ蛋白陽性表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 ERRα與ERRβ蛋白表達的相關(guān)性

Spearman rank相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中ERRα與ERRβ蛋白的陽性表達率呈正相關(guān)（rs=0.309，P=0.017）。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程是多基因、多階段的過程[6]。ERR是一種細胞核受體，調(diào)節(jié)細胞的代謝過程，尤其在高能量需求細胞內(nèi)，ERR表達活躍[7]。最近研究表明，ERR與惡性腫瘤的進展具有相關(guān)性，在乳腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、前列腺癌、卵巢癌、肉瘤等腫瘤中高表達，與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)[8-9]。而且，在ERR陽性表達的乳腺癌等惡性腫瘤細胞中，腫瘤對化療藥物耐藥發(fā)生率較高。

本研究結(jié)果顯示，ERRα和ERRβ蛋白表達于結(jié)腸癌及癌旁組織細胞核，在癌組織中表達較強，癌旁組織中表達較弱，ERR在癌組織中表達水平高于癌旁組織，表明ERR可能參與結(jié)腸癌惡變過程或惡性腫瘤的某些生物學(xué)行為。有研究顯示，在結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織中有ERRα mRNA表達，可以檢測到ERRα轉(zhuǎn)錄；ERRα蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達受到調(diào)控。本研究結(jié)果進一步顯示，結(jié)腸癌組織中ERRα、ERRβ蛋白陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型、病理類型無關(guān)，而與腫瘤浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度有關(guān)，表明ERR可能與結(jié)腸癌惡性行為具有相關(guān)性，ERR高表達提示腫瘤浸潤更深，遠處轉(zhuǎn)移概率更大，分期更高，分化更差，可能預(yù)示著結(jié)腸癌的不良預(yù)后[10]。在TNM Ⅱ～Ⅳ級結(jié)腸癌組織中，ERRα表達量高于癌旁組織，說明ERRα可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展等惡性行為。多項研究表明，ERRα高表達的乳腺癌細胞浸潤、遷徙及增殖能力均高于ERRα陰性表達細胞，ERRα高表達提示患者更短的生存期及不良預(yù)后[11]。ERRα及ERRβ具有與ERRα相同或者相似的結(jié)構(gòu)域。有研究顯示，ERRα與ERRα識別的靶序列具有嚴(yán)格特異性，少部分基因既可被ERRα調(diào)控又可被ERRα調(diào)控，在這部分基因中兩者具有同樣的結(jié)合位點，并作用于同一調(diào)控區(qū)的不同調(diào)控位點，因此，ERR在結(jié)腸癌中可能與ERRα發(fā)揮相同或相似的作用[12]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中ERRα與ERRβ蛋白的陽性表達率呈正相關(guān)，表明結(jié)腸癌中不同亞型ERR可能均參與其作用，但兩者具體的作用機制需進一步實驗證實。以往對ERR的研究集中在乳腺癌及卵巢癌等與內(nèi)分泌密切相關(guān)的腫瘤，但ERR在消化系統(tǒng)惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及進展過程中可能也發(fā)揮重要調(diào)控作用。近年來，對于腫瘤化療藥耐藥性方面的研究不斷深入，ERR是否對結(jié)腸癌細胞化療耐藥具有調(diào)控作用，也逐漸受到關(guān)注[13]。BERNATCHEZ等[14]研究認為，在浸潤及轉(zhuǎn)移性強的結(jié)腸癌細胞中，ERRα能促進離體結(jié)腸癌細胞的增殖及癌巢的形成，這可能與腫瘤細胞的高代謝要求有關(guān)，腫瘤細胞的高代謝需求促進ERRα的過表達，使腫瘤細胞分化及增殖加速。ERRα下調(diào)的離體腫瘤細胞會出現(xiàn)明顯G1～S期的延遲，削弱了腫瘤細胞的增殖能力。HU等[13]的研究結(jié)果也在蛋白水平證明ERRα及ERRβ與結(jié)腸癌的相關(guān)性，但相關(guān)的分子生物學(xué)機制需進一步實驗研究。

總之，ERRα和ERRβ在結(jié)腸癌組織中高表達，并與結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征具有相關(guān)性，提示結(jié)腸癌預(yù)后不良，兩者可能對結(jié)腸癌的惡性行為具有調(diào)控作用。ERRα和ERRβ可能作為結(jié)腸癌預(yù)后的標(biāo)志物或預(yù)后因素，也可能作為靶向治療的候選靶點。

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Expressions of ERRα and ERRβ in colon cancer tissue and their clinical significance*

Hai-hong Liu1, Gang Shi2, Rui Zhang2
(1.department of Surgery, Hospital of Northeastern University, Shenyang, Liaoning 110004, China; 2.department of Colorectal Surgery, Liaoning Cancer Hospital and Institute, Shenyang, Liaoning 110042, China)

ObjectiveTodetect the expressions of estrogen-related receptor α (ERRα) and ERRβ in colon cancer, evaluate their relationships with the clinicopathological characteristics anddiscuss the clinical significance.MethodsColon cancer tissues and para-cancerous normal tissues were selected from 63 patients. Western blot was used todetect the expressions of ERRα and ERRβ and their correlations with clinicopathological characteristics were observed.ResultsERRα and ERRβ were expressed in the nuclei of the colon cancer tissues and the para-cancerous tissues, high expression was observed in the cancer tissues and low expression was seen in the para-cancerous tissues. The positive expression rates of ERRα and ERRβ in the colon cancer tissues were higher than those in the para-cancerous tissues (P＜ 0.05). The positive expressions of ERRα and ERRβ proteins were correlated with thedeepth of tumor invasion,distant metastasis, blood vessel in filtration, TNM stage and tumor differentiation (P＜ 0.05). Spearman rank analysis showed the positive expression rates of ERRα and ERRβ proteins were positively correlated (P＜ 0.05).ConclusionsERRα and ERRβ are highly expressed in colon cancer tissues and correlated with the clinicopathological characteristics of poor prognosis. They may modulate the malignant behavior of colon cancer together.

colon cancer; estrogen-related receptor α; estrogen-related receptor β

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.007

1005-8982（2018）02-0037-05

R735.8

A

2016-12-15

國家自然基金（No：81672427）

張睿，E-mail：bluesky2016@aliyun.com；Tel：02486309876

（童穎丹 編輯）